陳穎 伍善廣 葉娟 陳艷婷

摘 要：采用乙醇注入法制備[α]-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體，以凍干后的外觀和再分散性作為篩選凍干保護(hù)劑的評價(jià)指標(biāo)，確定以蔗糖和甘露醇聯(lián)用作為凍干保護(hù)劑，兩者的配比為糖∶醇=3∶7，總含量為20%.以凍干率為評價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)對凍干工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定凍干曲線中預(yù)凍溫度為-50 ℃，預(yù)凍時(shí)間為9 h；升溫時(shí)間為9 h；主升華干燥溫度為-30 ℃，維持12 h，壓力為15 Pa；之后以5 ℃/h的速度升溫；解析干燥溫度為35 ℃，維持5 h，壓力為10 Pa.制備的α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體凍干工藝重復(fù)性、穩(wěn)定性好，生產(chǎn)可行性高.

關(guān)鍵詞：真空冷凍干燥；α-細(xì)辛腦；長循環(huán)前體脂質(zhì)體；正交試驗(yàn)；凍干工藝

中圖分類號：TQ460.7 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2018.04.009

0 引言

α-細(xì)辛腦（α-asarone，ARE）是天南星科植物石菖蒲中的主要成分之一[1].細(xì)辛腦具有緩解患者臨床癥狀，改善肺部通氣功能，促進(jìn)痰液排出，減輕氣道黏膜充血水腫并保護(hù)氣道黏膜等作用[2].但由于α-細(xì)辛腦自身脂溶性很強(qiáng)，水溶性很差，普通制劑的生物利用度很低，嚴(yán)重影響其療效的發(fā)揮，如細(xì)辛腦膠囊劑和片劑的絕對生物利用度僅為2.73%和5.56%[3-4].脂質(zhì)體作為新型藥物載體，在改善藥物溶解速率，增強(qiáng)藥物靶向性、緩釋性、低毒性等方面具有良好的效果[5].在普通脂質(zhì)體基礎(chǔ)上加入高分子材料聚乙二醇（PEG）來改變脂質(zhì)體表面親水性亞結(jié)構(gòu)，形成表面有高分子材料包裹的脂質(zhì)體，以減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對脂質(zhì)體的吞噬吸收從而延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，通過這種方式增加藥物在體內(nèi)的釋放時(shí)間提高療效以及減少不良反應(yīng)的發(fā)生[6].但是脂質(zhì)體混懸液穩(wěn)定性較差，貯存時(shí)間較短，在儲存過程中存在聚集、融合、藥物泄露、水解、氧化等問題[7-8]，用冷凍干燥法制得的凍干脂質(zhì)體能夠降低磷脂和藥物的氧化速度，顯著提高穩(wěn)定性[9]，便于貯存和運(yùn)輸.因此，本文以乙醇注入法制備α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體，通過冷凍干燥技術(shù)將脂質(zhì)體制備成前體脂質(zhì)體，先對凍干保護(hù)劑進(jìn)行了篩選，再通過正交試驗(yàn)優(yōu)化凍干工藝，并對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià).

1 儀器與材料

1.1 儀器

申辰BT100N型蠕動泵；予華DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；江南XS-213光學(xué)顯微鏡；HANGPING FA2204B電子天平；雷磁PHS-2F pH計(jì)；安捷倫 1260 Infinity 高效液相色譜儀；LGJ-15D四環(huán)冷凍干燥機(jī)；德國IKA GENIUS 3漩渦混勻器；馬爾文Zetasizer Nano-ZS90 納米粒度儀；德國IKA T18高速分散勻質(zhì)機(jī).

1.2 材料

Sephadex G-50（上海源聚生物科技，進(jìn)口分裝）；α-細(xì)辛腦原料藥（廣西億康藥業(yè)，批號：150506，純度：98.6%）；大豆磷脂 Lipoid S 100（德國Lipoid公司，批號：579010-1150055-13，磷脂含量[≥]94%）；膽固醇（上海藍(lán)季科技，批號：100918）；Vit E（武漢銀河化工，批號：20091015）；聚乙二醇Lipoid DSPE-PEG-2000（德國Lipoid公司，批號：588200-2150067-01）；甲醇（天津科密歐，色譜純）.

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備[10]

用乙醇注入法制備α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體，按處方量精密稱取大豆磷脂、膽固醇、聚乙二醇（PEG-2000）和α-細(xì)辛腦原料藥，加入適量恒溫?zé)o水乙醇，攪拌使其完全溶解，用微量注射器將無水乙醇溶液慢慢勻速注入55 ℃水浴恒溫的PBS 緩沖液（ pH = 6.8 ）中，攪拌30 min，加熱50 min，盡量將乙醇揮發(fā)盡，水浴放置1 h使其充分水合，用高速分散勻質(zhì)機(jī)勻質(zhì)30 min，密封3 ℃下避光保存，即得 α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體.

2.2 脂質(zhì)體包封率測定[11]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Hypersil（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（65∶35，v/v）；檢測波長：313 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 mL.

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

精密稱取α-細(xì)辛腦10 mg，置于100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得α-細(xì)辛腦貯備液；精密量取該貯備液0.4、0.7、2.1、3.5、4.9、6.3、7.0、8.0、9.0 mL分別置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻.分別取上述溶液按照2.2.1方法進(jìn)行液相色譜分析，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得線性方程A=45.364C-69.668，R=0.999 9.結(jié)果表明：α-細(xì)辛腦在4～90 mg/mL檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好.

2.2.3 凝膠柱分離測定長循環(huán)脂質(zhì)體中包含的藥物

Sephadex-G50色譜柱（1.6 cm×50 cm）先用pH6.8 PBS平衡好，吸取1 mL長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液，用pH6.8 PBS洗脫，流速為 1.0 mL/min.收集帶有乳光的洗脫液，用適量甲醇破乳至完全澄清，按“2.2.1”條件測定脂質(zhì)體中ARE的含量.

2.2.4 包封率測定

精密量取α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體1 mL，加入一定量的甲醇破乳，待溶液完全澄清透明后用流動相稀釋至一定濃度，按“2.2.1”條件進(jìn)行測定，求出脂質(zhì)體中α-細(xì)辛腦的總含量.精密量取α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)行試驗(yàn)，測定脂質(zhì)體中α-細(xì)辛腦的含量.按下式計(jì)算包封率[12]：包封率（%）=（W包/W總）×100%（W總——總藥物量，W包——包入脂質(zhì)體的藥物量）.

2.3 α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體凍干工藝的研究

2.3.1 凍干保護(hù)劑初步篩選

為保證凍干后能保持原有體積不變，凍干制劑不出現(xiàn)塌陷與皺縮，復(fù)溶再分散性良好，并保證凍干后包封率和粒徑保持一定水平，在凍干前需要加入凍干保護(hù)劑.本文考察了蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇和甘氨酸等不同凍干保護(hù)劑對所制備的脂質(zhì)體凍干樣品的影響.因?yàn)閮龈杀Ｗo(hù)劑要為膜材磷脂質(zhì)量的2倍以上才能取得較好的凍干效果，凍干保護(hù)劑的濃度越大凍干效果越好.但若凍干樣品的濃度太大，凍干品表面會產(chǎn)生皺縮、起皮和開裂，凍干樣品的固含量維持在4%～25%之間最為合適.由于脂質(zhì)體的膜材已接近5%，因此固定凍干保護(hù)劑的總含量為20%.按處方量稱取保護(hù)劑置于西林瓶中，用1 mL去離子水超聲溶解后，加入1 mL α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液，振蕩混勻，液面高度大致1 cm，經(jīng)過初步凍干后，以凍干后脂質(zhì)體樣品的外形、色澤以及凍干品的再分散性對凍干工藝進(jìn)行評價(jià).其中以凍干樣品表面塌陷萎縮、脫離瓶壁、顏色變深、空洞或起泡記為<60分；以略有塌萎縮、顏色不均勻、表面起殼呈皸裂狀記為60～70分；以體積飽滿、顏色潔白均一、表面開裂起皮記為70～80分；以體積飽滿、表面光潔平整、顏色潔白均一，呈疏松粉餅狀者為最佳記為>80分.結(jié)果見表1.

結(jié)果表明：甘露醇為保護(hù)劑時(shí)凍干產(chǎn)品顏色潔白、體積較飽滿、整體較平整細(xì)膩，但再分散性較差，而且在顯微鏡下觀察，凍干后的脂質(zhì)體粒徑較大，有藥物晶體析出；用蔗糖作為保護(hù)劑則再分散性較好，在顯微鏡下觀察凍干前后脂質(zhì)體粒徑無明顯變化，但成形不好，所得的凍干制品嚴(yán)重萎縮.經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)初步篩選，確定以甘露醇和蔗糖聯(lián)合使用作為凍干保護(hù)劑.

2.3.2 凍干保護(hù)劑配比的篩選

蔗糖作為凍干保護(hù)劑常用的濃度為2%～5%；甘露醇常用的濃度為1%～10%，當(dāng)蔗糖∶甘露醇≤2∶7，凍干品雖成形性好，但再分散性差，且在顯微鏡下觀察有較多藥物晶體析出；蔗糖∶甘露醇≥7∶3，凍干品顏色會變黃，且不能很好的成形.綜合以上因素，考察蔗糖與甘露醇聯(lián)用為凍干保護(hù)劑時(shí)兩者配比分別為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，經(jīng)初步凍干后，結(jié)果見表2（外觀評分標(biāo)準(zhǔn)見2.3.1）.

結(jié)果表明，蔗糖與甘露醇配比為3∶7和4∶6無明顯差別，但由于甘露醇含量高導(dǎo)致分散性較差.因此，本次試驗(yàn)選擇的凍干保護(hù)劑的配比為蔗糖∶甘露醇=4∶6.

2.3.3 凍干工藝的考察

選用L9（34）正交表[13-14]（見表3），以預(yù)凍溫度和時(shí)間（A）、升溫時(shí)間（B）、主升華干燥溫度和壓力（C）、解析干燥溫度和壓力（D）為影響因素，以凍干率作為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn).

凍干后脂質(zhì)體樣品凍干率是物料凍干后脫水質(zhì)量占物料水分總量的比例，凍干率%=100%-水分含量%，水分含量用干燥失重法進(jìn)行測定.正交試驗(yàn)結(jié)果見表4.

表4顯示，RB>RA>RD>RC，即升溫時(shí)間為主要影響因素，預(yù)凍時(shí)間為次要影響因素.由于ⅢA>ⅡA>ⅠA；ⅢB>ⅡB>ⅠB；ⅠC>ⅡC>ⅢC；ⅢD>ⅠD>ⅡD，因此得出最佳凍干工藝為A3B3C1D3，即預(yù)凍時(shí)間為9 h，溫度為-50 ℃；升溫時(shí)間為9 h；主升華干燥溫度為-30 ℃，壓力為15 Pa；解析干燥溫度為35 ℃，壓力為10 Pa.

2.4 α-細(xì)辛腦長循環(huán)凍干脂質(zhì)體的質(zhì)量評價(jià)

按照最優(yōu)處方及最佳凍干工藝制備3批α-細(xì)辛腦長循環(huán)凍干脂質(zhì)體，分別對其包封率、水分、粒徑和Zeta電位進(jìn)行考察，其結(jié)果如表5所示.

檢驗(yàn)結(jié)果顯示：3批凍干樣品外觀均為飽滿潔白的疏松粉餅狀物質(zhì)，復(fù)溶后的脂質(zhì)體溶液與未凍干脂質(zhì)體溶液外觀之間無差異，且3批樣品之間的含水量、包封率、粒徑和Zeta電位并無明顯差異.證明該凍干工藝重復(fù)性好，在生產(chǎn)上具有可行性.

3 討論

1）脂質(zhì)體的凍干過程中必須使用凍干保護(hù)劑以降低凍干和水化過程對脂質(zhì)體的損害，使脂質(zhì)體的凍干制劑能夠有良好的外觀和再分散性，同時(shí)維持脂質(zhì)體的包封率和粒徑，保證脂質(zhì)體的藥效.本次研究發(fā)現(xiàn)蔗糖的凍干保護(hù)作用要優(yōu)于海藻糖和乳糖，且具有良好的復(fù)溶再分散性，但其塌陷溫度低（-32 ℃），也即主升華干燥溫度低，凍干效率低；賦形劑中凍干效果最佳的是甘露醇，其完全沒有吸濕性，而且塌陷溫度高（-1.5 ℃），能夠降低水的結(jié)晶速度，達(dá)到良好的支撐效果，保證凍干制劑外觀飽滿，但是甘露醇復(fù)溶再分散性較差.本次研究選用甘露醇和蔗糖為聯(lián)合保護(hù)劑可互補(bǔ)缺點(diǎn)，保證凍干粉外觀及復(fù)溶后的理化性質(zhì).

2）導(dǎo)致凍干制品出現(xiàn)如孔洞、塌陷、干縮、鼓泡和顏色變深等缺陷的原因有很多，其中主要原因有：①預(yù)凍時(shí)間太短，制品尚未完全凍結(jié)，在這種情況下開真空升華，外部壓力迅速降低，就會引起鼓泡甚至噴瓶；②主升華干燥溫度過高會導(dǎo)致制品溶化揮發(fā)，最后呈萎縮狀態(tài)；③部分制品未完全干燥，如果加熱過猛會出現(xiàn)熔化，而已干部分的固體物質(zhì)會再溶解，這樣也會造成凍干品塌陷.因此，預(yù)凍階段必須保證樣品完全凍牢，即預(yù)凍溫度需低于樣品的共晶點(diǎn)溫度10 ℃～20 ℃，且預(yù)凍時(shí)間要足夠長；并且在主升華干燥階段必須控制好隔板溫度，在該階段下的制品溫度不能超過樣品的共熔點(diǎn)溫度；凍干過程的真空度不能太低也不能太高，太高不利于傳熱，太低不利于水分蒸發(fā)，應(yīng)保持在10～15 Pa左右.

3 ）本次試驗(yàn)研究了α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體凍干劑的制備工藝，包括凍干保護(hù)劑的選擇和凍干工藝的確定，通過正交試驗(yàn)分析了不同因素對α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體凍干制劑質(zhì)量的影響，選擇-50 ℃作為預(yù)凍溫度，保證了藥液能完全凍結(jié)；升華干燥采用的是階段式升溫，對凍干制品的質(zhì)量進(jìn)行檢查.通過凍干劑聯(lián)合使用，在保證成品外觀形狀等物理指標(biāo)方面均一性好的情況下，也保證了成品加入溶劑后可迅速完全溶解.通過把α-細(xì)辛腦長循環(huán)脂質(zhì)體制備成凍干品，提高其穩(wěn)定性，易于保存與運(yùn)輸.制得的成品為白色疏松粉餅狀物質(zhì)，平均粒徑為200 nm左右，各項(xiàng)指標(biāo)均較優(yōu)，凍干工藝合理且重復(fù)性佳，實(shí)現(xiàn)了試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的，此項(xiàng)工作為制備α-細(xì)辛腦長循環(huán)前體脂質(zhì)體提供了理論依據(jù).

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Study on freeze-drying process of the long-circulated lyophilized liposome

of α-asarone

CHEN Ying1， WU Shanguang2， YE Juan1， CHEN Yanting1

（1.Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou 510520， China；2.Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： α-asarone liposomes were prepared by ethanol injection. The appearance and redispersibility of freeze-dried α-asarone liposomes were selected as evaluation indexes for lyophilization protectant，the combination of saccharose and mannitol was used as a freeze-drying protective agent. The cryoprotective was 20% saccharose-mannitol （3∶7） and the optimum process of freeze-drying was： pre-freeze for 9 h at -50 ℃，the heating-up time was 9 h； primary-drying for 12 h at -30 ℃，vacuum was 15 Pa； the temperature of desorption was 35 ℃ and maintaining 5 h，vacuum was 10 Pa. Stable α-asarone long-circulated lyophilized liposome could be obtained by screening cryoprotectives and optimizing freeze-drying process parameters and the physicochemical characters were good. The confirmatory test has proofed the feasibility and stability of the process.

Key words： vacuum freeze-drying technology； α-asarone； long-circulated lyophilized liposome； orthogonal test； freeze-drying process

（學(xué)科編輯：黎 婭）