秦建立 楊光宇

摘 要：選用玉蜀黍赤霉、枯草芽孢桿菌、石斛小菇3種細(xì)菌和真菌菌株以及與水楊酸、硝酸鑭、色氨酸、赤霉素結(jié)合配制16種液體處理劑，并以灌根方式處理，接種大棚鐵皮石斛組培苗。結(jié)果表明：4 g·L-1石斛小菇、5 mg·L-1赤霉素、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1硝酸鑭、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1赤霉素+1 mmol·L-1水楊酸處理的鐵皮石斛組培苗株高顯著高于對(duì)照組（無(wú)菌水處理）；4 g·L-1石斛小菇、5 mg·L-1赤霉素、1 mmol·L-1水楊酸、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1硝酸鑭、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1赤霉素+1 mmol·L-1水楊酸莖粗顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明接種4 g·L-1石斛小菇、5 mg·L-1赤霉素、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1硝酸鑭、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1赤霉素+1 mmol·L-1水楊酸液體處理劑處理能有效提高幼苗的株高、莖粗，液體處理劑有良好的促生效果。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；菌根真菌；液體處理劑；促生

Abstract： Sixteen liquid treatment agents were formulated with the combination of three bacteria or fungal， Gibberella zeae， Bacillus subtilis and Mycena dendrobii， and salicylic acid， lanthanum nitrate， tryptophan and gibberellin， and treated tissue culture seedling of Dendrobium officinale in greenhouse by root irrigation. The results showed that the treatments of 4 g·L-1 Mycena dendrobii， 5 mg·L-1 gibberellin， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 gibberellic acid+1 mmol·L-1 salicylic acid could significantly increase the plant height of Dendrobium officinale compared to the control （sterile water treatment）； The stem diameter of 4 g·L-1 Mycena dendrobii， 5 mg·L-1 gibberellin， 1 mmol·L-1 salicylic acid， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate treatments were significantly higher than that of the control group. It was indicated that the treatments of 4 g·L-1 Mycena dendrobii， 5 mg·L-1 gibberellin， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 gibberellic acid+1 mmol·L-1 salicylic acid could increase the plant height and stem diameter effectively， the liquid treatment agents of which had good growthstimulating effects on tissue culture plantlets of Dendrobium officinale in greenhouse.

Key words： Dendrobium officinale； mycorrhizal fungi； liquid treatment agent； growth stimulation

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，被列為國(guó)家一級(jí)野生保護(hù)植物，屬于石斛屬植物，是蘭科植物中的第二大屬，主要產(chǎn)于溫涼高濕地帶，其所處的相對(duì)濕度、溫度、光照等環(huán)境因子對(duì)其影響很大，生長(zhǎng)發(fā)育最好能與其他有益微生物混合生長(zhǎng)[2]。目前對(duì)野生石斛的過(guò)度采挖和利用，導(dǎo)致其已無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，因此，人工栽培市場(chǎng)前景較好[3]。

由于根際促生菌劑能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，防治作物病害，抵御生長(zhǎng)環(huán)境中的有害病原菌，因此受到人們的廣泛重視[4]。近年來(lái)對(duì)根際促生菌劑的研究已成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。根際微生物菌劑主要運(yùn)用于如草莓、各種瓜類(lèi)、果樹(shù)等移栽作物[5]。中國(guó)研制開(kāi)發(fā)的彩色馬勃菌根固體劑型用于松樹(shù)育苗，可增加苗高、根徑、側(cè)根數(shù)，造林成活率增長(zhǎng)幅度可高達(dá)169%[6]。目前菌劑的應(yīng)用研究多為單一菌株以及少數(shù)的多種菌株，國(guó)內(nèi)推廣應(yīng)用的菌劑主要有促生菌劑、根瘤菌劑、固氮菌劑、解磷菌劑和解鉀菌劑等，關(guān)于復(fù)合液體處理劑對(duì)鐵皮石斛組培苗的促生作用研究報(bào)道較少。

目前鐵皮石斛人工種植均采用組培苗，存在著成本高、移栽成活率低、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量低等問(wèn)題[7]。在自然條件下，蘭科植物菌根真菌的共生對(duì)于鐵皮石斛種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)是必不可少的[8]。自然條件下野生石斛的結(jié)實(shí)率很低，加上種子沒(méi)有胚乳直接提供營(yíng)養(yǎng)，前期幼苗很難萌發(fā)，且其移栽成活率很低，石斛種子的萌發(fā)和植株的生長(zhǎng)發(fā)育都需依賴(lài)菌根真菌與之共生，進(jìn)而形成共生菌根有利于根部對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[9]。因此研究石斛菌根真菌與寄主植物的相互關(guān)系以及復(fù)合液體處理劑對(duì)鐵皮石斛組培苗的促生作用具有重要意義。

本課題組在前人的基礎(chǔ)工作之上研究以玉蜀黍赤霉、枯草芽孢桿菌和石斛小菇這3種菌株以及4種添加劑配制有益鐵皮石斛的液體處理劑，對(duì)鐵皮石斛組培苗促生作用方面進(jìn)行研究，擬解決鐵皮石斛因缺少菌根真菌導(dǎo)致生長(zhǎng)慢、資源不足的難題，對(duì)有效提高出瓶組培苗的成活率和生長(zhǎng)質(zhì)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：本試驗(yàn)的菌株石斛小菇（Mycena）來(lái)自鐵皮石斛的根部，于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心管理購(gòu)買(mǎi)；玉蜀黍赤霉（ Gibberella）于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買(mǎi)；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買(mǎi)，購(gòu)買(mǎi)后保存于實(shí)驗(yàn)室。

供試植株：鐵皮石斛組培苗來(lái)自福建省廈門(mén)市集美區(qū)塔斯曼生物工程有限公司，試驗(yàn)在該公司種植大棚內(nèi)的苗床上進(jìn)行，組培苗移栽至苗床后按照該公司大棚種植的常規(guī)方法進(jìn)行管理（移栽后澆定根水，以基質(zhì)澆透為準(zhǔn)，養(yǎng)護(hù)時(shí)每天定時(shí)噴霧4～5次，濕度保持在80%左右，待新根長(zhǎng)出后逐步減少?lài)婌F次數(shù)）。種苗統(tǒng)一選擇株高（3.0±0.2）cm、有2～3條根的小苗進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn)，在消過(guò)毒的松樹(shù)皮基質(zhì)上移栽馴化好的鐵皮石斛幼苗。采用苗床栽培，苗床離地70 cm左右，共設(shè)4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域約150叢苗，種植密度為3 株1 叢，叢行距3 cm×3 cm。

菌劑的制備：先將實(shí)驗(yàn)室保存的供試菌株在馬鈴薯葡糖糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）上活化2 d， 再將活性較好的菌株用PDA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)2 d，將菌絲團(tuán)取出瀝干后稱(chēng)重， 計(jì)算出每種菌株的總重量， 用無(wú)菌水配置成4 g·L-1的菌株；石斛小菇菌株在PDA固體培養(yǎng)基上活化2 d后用PDA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至2周， 將菌絲團(tuán)取出瀝干后稱(chēng)重， 計(jì)算出每種菌株的總重量， 用無(wú)菌水配置成4 g·L-1的菌株；枯草芽孢桿菌在胰蛋白胨大豆瓊脂液體培養(yǎng)24 h后，有效活菌數(shù)的測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)稀釋法，取10倍系列稀釋在胰蛋白胨大豆瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，配制濃度為8.0×107 CFU·mL-1左右。

1.2 試驗(yàn)方法

選取健壯、株高高度一致的鐵皮石斛組培苗用于接種，試驗(yàn)按單因素和多因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置多組處理組見(jiàn)表1，以灌根無(wú)菌水為對(duì)照（CK），每個(gè)處理10 株，重復(fù)3 次。

1.3 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

統(tǒng)一條件管理，移栽70 d后從各組中隨機(jī)挑選10叢苗， 取叢中長(zhǎng)勢(shì)最好的10株用流水沖洗干凈并晾干。分別測(cè)量不同處理幼苗的株高、莖粗等生長(zhǎng)指標(biāo)，每組重復(fù)3次測(cè)量求其平均值。

計(jì)算各處理組平均株高增量 （H）、平均莖粗增量 （S） ，根據(jù)幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)來(lái)衡量液體處理劑的促生長(zhǎng)效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行不同處理間的記錄、統(tǒng)計(jì)、制表繪圖，采用SPSS22.0進(jìn)行方差分析（LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體處理劑處理對(duì)鐵皮石斛株高增量的影響

由圖1可知，對(duì)照組平均株高增量為0.39 cm，除1、2、11、15號(hào)處理組以外，其余各處理平均株產(chǎn)量均高于對(duì)照組，其中3號(hào)（1.18 cm）、4號(hào)（1.24 cm）、12（1.25 cm）和13號(hào)（1.00 cm）處理的平均株高增量顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的3、3.2、2.5和2.5倍。結(jié)果表明液體處理劑的施用能夠有效促進(jìn)鐵皮石斛組培苗的株高生長(zhǎng)。

2.2 不同液體處理劑處理對(duì)鐵皮石斛莖粗的影響

由圖2可知，對(duì)照組平均莖粗增量為0.51 mm， 除1、2、8、9、10、11、14、15號(hào)處理組以外，其余各處理平均莖粗增量均高于對(duì)照組，其中3號(hào)（1.11 mm）、4號(hào)（0.89 mm）、5號(hào)（1.36 mm）、12號(hào)（0.92 mm）、13號(hào)（1.04 mm）處理的平均莖粗增量顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的2.2、1.7、2.7、1.8和2倍。結(jié)果表明液體處理劑的施用能夠有效促進(jìn)鐵皮石斛組培苗的莖粗生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛生長(zhǎng)狀況與自身激素水平以及外界的營(yíng)養(yǎng)供給有關(guān)[10]。本試驗(yàn)所選赤霉素、水楊酸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均不同程度的對(duì)鐵皮石斛組培苗株高和莖粗有促進(jìn)作用，這一研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[11]。植物促生菌劑已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，具有促生作用的植物菌根真菌以及內(nèi)生細(xì)菌由于有足夠的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且受到植物組織或根的保護(hù)，更易于發(fā)揮作用[12]。菌根真菌對(duì)宿主植物的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在能更好地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、有利于次生代謝產(chǎn)物的積累等方面[13]，同時(shí)可以促進(jìn)宿主植物對(duì)氮、磷等礦質(zhì)元素的吸收，從而促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)[14]。IAA是以色氨酸為前體物質(zhì)，吲哚丙酮酸代謝途徑為其主要合成途徑[15]。但本試驗(yàn)所用色氨酸的處理組并未能對(duì)鐵皮石斛產(chǎn)生促生作用，可能原因是色氨酸濃度問(wèn)題，以及外界因素的影響導(dǎo)致。在以往接種添加劑多采用浸種、表面噴灑、涂抹的方式，由于本試驗(yàn)添加劑的灌根處理方式導(dǎo)致其4種添加劑未能表現(xiàn)出良好的促生效果。吳靜萍等[16]在密花石斛菌根真菌中發(fā)現(xiàn)赤霉素，且能向外分泌，并認(rèn)為適當(dāng)濃度的赤霉素能促進(jìn)石斛生根和莖的伸長(zhǎng)，此研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。添加劑物質(zhì)可能在不同程度對(duì)菌根真菌侵染存在差異[17]，因此還需后續(xù)探究驗(yàn)證。

石斛小菇菌根真菌能提高組培苗的株高和莖粗，在制成液體處理劑后避免了由真菌接種時(shí)含菌量過(guò)高而使共生關(guān)系失去平衡的問(wèn)題，也不會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)基的殘留而污染組培苗。液體處理劑能夠促進(jìn)鐵皮石斛組培苗的生長(zhǎng)，其原因可能與真菌能產(chǎn)生某些植物激素刺激組培苗的生長(zhǎng)，以及提高植物抗病抗逆機(jī)制或拮抗作用導(dǎo)致病原菌生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。由于植物菌根真菌生境具有特殊性，本試驗(yàn)中促生效果較好的液體處理劑能否適用于其他石斛植物，還有待進(jìn)一步研究。

目前，微生物菌劑多為單一菌，混合菌劑的報(bào)道不多。單一純培養(yǎng)接種物缺少鐵皮石斛生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，育苗初期效果不佳，難以推廣。菌根真菌種類(lèi)豐富多樣，其資源有待開(kāi)發(fā)與利用，篩選新型高產(chǎn)高效的菌根真菌及復(fù)合菌劑是目前研究的熱點(diǎn)，今后將會(huì)有更廣闊的發(fā)展前景。本試驗(yàn)研制含有菌根真菌與色氨酸、赤霉素、硝酸鑭、水楊酸的復(fù)合處理劑與傳統(tǒng)方式不同，菌劑的配方組合打破以往單一固體接種物的模式，避免了長(zhǎng)期使用植物激素、單一菌劑、化肥、農(nóng)藥所帶來(lái)的弊端，為我國(guó)菌根菌劑商品化生產(chǎn)提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐程，沈穎，張銘.石斛屬藥用植物鑒定研究[J].中草藥，2004，35（8）：11-12.

[2]吳征鎰.中國(guó)植物志（第19卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[3]諸燕.鐵皮石斛11種金屬元素含量測(cè)定[C].全國(guó)藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會(huì)，2010.

[4]郭鳳仙，劉越，唐麗，等.藥用植物根際微生物研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2017，19（5）：12-21.

[5]王鵬.果樹(shù)菌根生物肥料的研究現(xiàn)狀[J].浙江柑橘，2013，30（4）：2-6.

[6]姚青.菌根真菌外生菌絲對(duì)難溶性無(wú)機(jī)磷酸鹽的活化及利用間接標(biāo)記法[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2000，14（3）：145-150.

[7]徐文婷.石斛內(nèi)生真菌固體菌劑對(duì)鐵皮石斛組培苗促生作用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（1）：317-324.

[8]陳寶玲，宋希強(qiáng)，胡美姣，等.美花石斛菌根真菌接菌方式與接種效應(yīng)初步研究[J].植物研究，2011，31（1）：79-84.

[9]張延威.石斛莖部?jī)?nèi)生真菌的分離與分布[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：18-19.

[10]黃萬(wàn)琳.不同培養(yǎng)基激素配比及營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)云南熱區(qū)鐵皮石斛苗的影響[J].曲靖師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，32（3）：60-63.

[11]孔凡信，劉志，趙術(shù)偉，等.4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)高粱株高、莖粗的影響[J].農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2015（5）：20-21.

[12]喻江.植物根組織內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生作用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（13）：169-175.

[13]丁常宏.都曉偉，徐瑩，藥用植物內(nèi)生真菌的功能研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2013，41（3）：168-171.

[14]石偉琦.丁效東，張士榮，叢枝菌根真菌對(duì)羊草生物量和氮磷吸收及土壤碳的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（2）：357-362.

[15]趙曉菊.吲哚乙酸生物合成及其結(jié)合物水解的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2014，30（6）：254-259.

[16]吳靜萍，錢(qián)吉，鄭師章.蘭花菌根菌分泌物成分的初步分析[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（7）：845-848.

[17]楊中寶，王淼焱，劉潤(rùn)進(jìn).外源養(yǎng)分和激素對(duì)AM真菌侵染和產(chǎn)孢的影響[J].菌物學(xué)報(bào)， 2005，24（2）：277-282.

（責(zé)任編輯：柯文輝）