蔡雁 欽富華 胡英 魏瑞龍

中圖分類號 R944；R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1600-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.04

摘 要 目的：制備關(guān)節(jié)腔注射用雙醋瑞因（DCR）聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球，并考察其相關(guān)性質(zhì)。方法：以PLGA為微球材料，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備DCR-PLGA微球；以高效液相色譜法測定DCR-PLGA微球的含量并計(jì)算載藥量及包封率；以包封率為評價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝；通過光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡觀察微球的形態(tài)及粒徑；以體外釋放試驗(yàn)考察其累積釋放度。結(jié)果：DCR的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.1～105.0 ?g/mL（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率試驗(yàn)的RSD均小于2.0%；最優(yōu)工藝條件為PLGA的質(zhì)量濃度為200 mg/mL，油水兩相的體積比為1 ∶ 50，聚乙烯醇體積分?jǐn)?shù)為1%。所得DCR-PLGA微球形態(tài)圓整，平均粒徑為（11.2±4.7）μm，載藥量為（4.25±0.26）%，包封率為（92.30±1.93）%，360 h內(nèi)累積釋放度為（73.08±5.33）%。結(jié)論：成功制得DCR-PLGA微球，其形態(tài)良好，粒徑適宜，具有較好的緩釋作用，適合關(guān)節(jié)腔注射給藥。

關(guān)鍵詞 雙醋瑞因；關(guān)節(jié)腔注射；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；微球；體外釋放；性質(zhì)

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Diacerein （DCR）-loaded （poly lactic-co-glycolic acid） PLGA microspheres for intra-articular injection and investigate its related properties. METHODS： PLGA was used as microspheres material， and the microsphere was prepared by emulsification solvent evaporation method. The contents of DCR-PLGA microspheres were determined by HPLC， and drug-loading amount and entrapment efficiency were also calculated. Using entrapment efficiency as evaluation index， the preparation technology was optimized by orthogonal test. The morphology and particle size of microspheres were observed by optical microscope and SEM. Accumulative release rate was investigated by using in vitro release test. RESULTS： The linear range of DCR was 2.1-105.0 ?g/mL （r=0.999 9）. RSDs of precision， stability， reproducibility and recovery tests were all lower than 2.0%. The optimal technology was PLGA concentration of 200 mg/mL， volume ratio of oil-water 1 ∶ 50， polyvinyl alcohol concentration of 1%. The prepared DCR-PLGA microspheres were spherical， average particle size was （11.2±4.7）μm， drug-loading amount was（4.25±0.26）% and encapsulation rate was（92.30±1.93）%， respectively. The drug release rate of DCR-PLGA microspheres within 360 h was about（73.08±5.33）%. CONCLUSIONS： DCR-PLGA microspheres are prepared successfully with good morphology， suitable particle size and obvious sustained release effect， which are suitable for intra-articular injection.

KEYWORDS Diacerein； Intra-articular injection； PLGA； Microspheres； in vitro drug release； Property

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）為一種退行性病變，是由多種因素引起的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，已成為中老年人群慢性致殘的主要原因之一[1]。目前，臨床對OA尚缺乏特異性的藥物治療方案，主要以減輕疼痛、改善代謝、延緩?fù)俗優(yōu)橹?；其常用藥物包括非甾體抗炎藥（NSAIDs）、選擇性Ⅱ型環(huán)氧化酶（COX-2）抑制劑及腎上腺皮質(zhì)激素等，但均存在明顯的不良反應(yīng)，如NSAIDs長期應(yīng)用可引起嚴(yán)重的胃腸不適和腎臟損害[2]。

蒽醌類衍生物雙醋瑞因（Diacerein，DCR）是一種治療OA的新型藥物。有研究顯示，DCR及其活性代謝產(chǎn)物大黃酸可抑制促炎因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的生成而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用[3]。此外，該藥還可以抑制軟骨降解，促進(jìn)軟骨合成[4]。臨床研究顯示，DCR能有效緩解OA患者疼痛，改善關(guān)節(jié)功能，與NSAIDs相比，患者用藥后胃黏膜損傷較小[4]。DCR以口服給藥為主，但因其溶解度極低，吸收差，而致起效緩慢、作用弱[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔注射用藥可使藥物直接與滑膜、軟骨等靶器官/組織接觸而發(fā)生作用，能更有效地控制OA模型大鼠的炎癥反應(yīng)，減少軟骨Ⅱ型膠原蛋白細(xì)胞的丟失[5]。但該給藥方式在關(guān)節(jié)腔易被快速清除，局部滯留時(shí)間短。為延長藥物釋放時(shí)間，減少給藥次數(shù)和用藥劑量，提高用藥依從性，本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為微球材料，制備了關(guān)節(jié)腔注射用DCR-PLGA微球，并對其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了考察。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括G1315D二極管陣列檢測器、G1312B二元泵、G1329B進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、LC-1260色譜工作站（美國Agilent公司）；S-3400N型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；SECURA125-1CN型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；DSC 3+差示掃描量熱儀（瑞士Mettler-Toledo公司）；SC-3616型臺式離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；XSZ-M207型光學(xué)顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；C-MAGHS4型磁力攪拌器（德國IKA公司）。

1.2 藥品與試劑

DCR原料藥（陜西弗森天然制品有限公司，批號：20170528，純度：>98%）；DCR對照品（浙江省中醫(yī)藥研究院，純度：99.3%，液相色譜面積歸一化法）；PLGA[山東省醫(yī)療器械研究所，批號：16072609，分子質(zhì)量：15 000 Da，丙交酯（LA）-乙交酯（GA）（50 ∶ 50），酯封端，特性黏度：0.18 dL/g]；聚乙烯醇（PVA1788，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160720）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 微球的制備

2.1.1 DCR-PLGA微球 采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備DCR-PLGA微球[6-7]。分別精密稱取DCR原料藥、PLGA各適量，置于小燒杯中，加二氯甲烷4 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min使其完全溶解作為油相，另配制一定質(zhì)量濃度的PVA1788溶液作為水相。于4 ℃冰浴條件下將油相緩慢滴入水相中，同時(shí)輔以1 000 r/min磁力攪拌，滴加完畢后繼續(xù)攪拌10 min，形成O/W 乳液。將上述O/W乳液轉(zhuǎn)移至兩倍體積的蒸餾水中，室溫（25 ℃）下繼續(xù)磁力攪拌（300 r/min）4 h使微球固化，得到微球混懸液。6 000 r/min離心10 min，收集微球，用蒸餾水洗滌3次，經(jīng)真空干燥48 h，得DCR-PLGA微球。

2.1.2 空白微球 不加DCR原料藥，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備空白微球。

2.2 DCR含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-水（用冰醋酸調(diào)pH至2.0）（65 ∶ 35，V/V）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L[8]。在該色譜條件下，DCR出峰時(shí)間適宜，峰形良好，分離度大于1.5，理論板數(shù)以DCR峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，詳見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的DCR對照品10.50 mg，置于50 mL量瓶中，加適量二甲基甲酰胺溶解，加甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為210 ?g/mL的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液2.0 mL，加流動(dòng)相定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為42.0 ?g/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1.1”項(xiàng)下制備的DCR-PLGA微球約20 mg，精密稱定，加適量二氯甲烷，超聲處理5 min使微球完全溶解，加甲醇定容至25 mL，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，加流動(dòng)相定容至10 mL，制成質(zhì)量濃度分別為2.1、4.2、10.5、21.0、42.0、105.0 ?g/mL的系列對照品溶液。分別取上述系列對照品溶液20 ?L，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以DCR質(zhì)量濃度（x，?g/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=54.054x+2.103 9（r=0.999 9）。結(jié)果表明，DCR的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.1～105.0 ?g/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下制備的低、中、高3種質(zhì)量濃度（2.1、21.0、105.0 ?g/mL）的對照品溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件于日內(nèi)分別連續(xù)進(jìn)樣測定5次，記錄峰面積并計(jì)算日內(nèi)精密度；按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 d，記錄峰面積并計(jì)算日間精密度。結(jié)果，低、中、高3種質(zhì)量濃度對照品溶液中DCR峰面積的日內(nèi)和日間RSD分別為0.67%、0.58%、0.81%和1.03%、0.74%、0.96%（n=5），表明日內(nèi)和日間精密度均良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，DCR峰面積的RSD為0.58%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下制備的DCR-PLGA微球適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算樣品含量。結(jié)果，DCR的平均含量為42.2 mg/g，RSD為0.56%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下制備的空白微球適量，共9份，分別置于25 mL量瓶中，每3份分別加“2.2.2”項(xiàng)下對照品貯備液0.25、2.5、12.5 mL，加二氯甲烷適量，超聲處理5 min使微球完全溶解，加甲醇定容，制成低、中、高3種質(zhì)量濃度（2.1、21.0、105.0 ?g/mL）的供試品溶液各3份，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算回收率。結(jié)果，低、中、高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液中的DCR的回收率分別為（99.42±0.88）%、（98.92±0.63）%、（101.15±1.07）%，RSD分別為0.89%、0.64%、1.06%（n=9），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 載藥量和包封率的測定

取“2.1.1”項(xiàng)下制備的DCR-PLGA微球約20 mg，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算DCR的含量[9]，進(jìn)而計(jì)算載藥量和包封率。載藥量（%）=微球中藥物質(zhì)量/微球的總質(zhì)量×100%；包封率（%）=微球中藥物質(zhì)量/藥物的投藥量×100%。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化微球制備工藝

在DCR-PLGA微球的制備過程中，載藥量和包封率受PLGA的種類、PLGA在有機(jī)相中的濃度、有機(jī)溶劑的種類、油水兩相的比例、藥物與聚合物的比例等因素的影響[10]。本研究在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定有機(jī)溶劑為二氯甲烷，藥物與聚合物的質(zhì)量比為1 ∶ 20，進(jìn)而選取油水兩相的體積比（A）、PLGA的質(zhì)量濃度（B）、PVA1788體積分?jǐn)?shù)（C）為因素，以包封率為指標(biāo)，優(yōu)化微球制備的工藝；每個(gè)因素取3個(gè)不同的水平，按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2、表3可知，對包封率影響程度大小為B>A>C，最優(yōu)工藝條件為B3A3C1，即PLGA的質(zhì)量濃度為200 mg/mL，油水兩相的體積比為1 ∶ 50，PVA1788體積分?jǐn)?shù)為1%。根據(jù)優(yōu)化的工藝條件制備DCR-PLGA微球3批，按“2.3”項(xiàng)下載藥量和包封率的測定方法，測得載藥量和包封率分別為（4.25±0.26）%和（92.30±1.93）%，表明優(yōu)化的工藝穩(wěn)定，適于制備DCR-PLGA微球。

2.5 DCR-PLGA微球的外觀形態(tài)觀察、流動(dòng)性、分散性和粒徑分布

“2.1.1”項(xiàng)下制備得到的DCR-PLGA微球外觀呈淡黃色粉末狀，流動(dòng)性好。將適量微球用水分散后制成載玻片，以測微尺測量微球粒徑，記錄300個(gè)微球的粒徑，計(jì)算微球的平均粒徑及粒徑分布[8]（見圖2），結(jié)果顯示微球的平均粒徑為（11.2±4.7）μm；同時(shí)，顯微鏡下觀察可見微球形態(tài)圓整，粒徑較為均勻，分散性良好（見圖3）。取適量DCR-PLGA微球，均勻分散后粘在雙面膠上，于銅板載樣臺上噴金后用掃描電鏡觀察微球的表面形態(tài)，DCR-PLGA微球的掃描電鏡圖見圖4。

2.6 DCR-PLGA微球的差示掃描量熱分析

分別取DCR原料藥、空白微球、空白微球與DCR原料藥的物理混合物（20 ∶ 1）及DCR-PLGA微球各約5 mg，放入鋁坩堝中，軋蓋后上機(jī)進(jìn)行差示掃描量熱分析。分析條件：掃描溫度25～280 ℃，升溫速率10 ℃/min，氮?dú)饬魉?00 mL/min，分析結(jié)果見圖5。

由圖5可知，DCR原料藥、空白微球與DCR原料藥的物理混合物在258 ℃處有吸收峰，空白微球在258 ℃處不出峰，DCR-PLGA微球在258 ℃處也不出峰，表明DCR-PLGA微球中的DCR可能以固態(tài)分子溶液或無定形而非結(jié)晶狀態(tài)存在。

2.7 DCR-PLGA微球的體外釋放試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下制備的DCR-PLGA微球約20 mg，精密稱定，加0.9%氯化鈉注射液2 mL分散均勻，置于截留分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋內(nèi)，兩端扎緊后置于離心管中，加釋放介質(zhì)（含0.02%疊氮化鈉的pH 7.4磷酸鹽緩沖液）20 mL；將離心管固定于水浴振蕩器中，設(shè)定溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速50 r/min，進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)。分別于1、4、8、12、24、48、96、144、192、240、360 h時(shí)取樣1 mL，并立即補(bǔ)充等溫的新鮮釋放介質(zhì)1 mL。供試品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算藥物累積釋放度（Q）[11]，以時(shí)間（t，h）為橫坐標(biāo)、藥物累積釋放度（Q，%）為縱坐標(biāo)繪制釋放曲線，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，DCR-PLGA微球360 h內(nèi)Q為（73.08±5.33）%，具有較好的緩釋作用。DCR-PLGA微球的體外釋放數(shù)據(jù)分別采用零級動(dòng)力學(xué)方程、一級動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程和Weibull方程進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)其符合Weibull方程，結(jié)果見表4。

3 討論

乳化-溶劑揮發(fā)法是目前制備PLGA微球最常用的方法之一[10]。但在制備過程中，除藥物的理化性質(zhì)外，諸多的處方和工藝參數(shù)對微球的成型性、粒徑、包封率和載藥量等有較大的影響。研究發(fā)現(xiàn)，微球的粒徑主要受攪拌速度影響，微球的成型性與PLGA的種類、PLGA在有機(jī)相中的濃度以及有機(jī)相滴加和揮發(fā)的速度等因素相關(guān)[10]。因影響因素較多且較為復(fù)雜，為簡化處理，本研究固定了攪拌速度、PLGA種類、藥物與聚合物的比例以及滴加速度等因素，主要考察了油水兩相的體積比、PLGA的質(zhì)量濃度、PVA1788體積分?jǐn)?shù)對包封率的影響。結(jié)果顯示，油水兩相的體積比和PLGA的質(zhì)量濃度為顯著影響因素，隨著水相體積的增加，微球固化速度加快，有利于藥物的包封，但是水相體積過大則可能因剪切力降低而導(dǎo)致微球粒徑增大；隨著PLGA的質(zhì)量濃度增加，有機(jī)相黏度增大，可減少藥物從微球向外水相擴(kuò)散，有利于提高藥物包封率，但是其質(zhì)量濃度太高則可能導(dǎo)致微球形態(tài)變差及粒徑增加。

DCR口服給藥后在體內(nèi)迅速分解為代謝產(chǎn)物大黃酸，而大黃酸難溶于水，胃腸道吸收差，起效緩慢，且易在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為大黃酸蒽酮而產(chǎn)生瀉下作用。注射方式給藥可將藥物直接遞送至關(guān)節(jié)腔，在局部形成較高的濃度，并可減小經(jīng)口服給藥產(chǎn)生的副作用。但普通注射劑給藥周期短，需頻繁給藥，患者用藥依從性差。緩釋微球是將藥物溶解或分散在高分子骨架材料中制成的微粒制劑，具有提高藥物穩(wěn)定性、延長藥物釋放、減少給藥頻率等優(yōu)勢，特別是以PLGA為載體材料制備的微球，具有良好的生物相容性和可降解性，且可通過選擇的材料類型調(diào)節(jié)藥物釋放速度，目前已被用于OA的治療中[12]。

本研究采用乳化-溶劑揮發(fā)法將DCR包載于PLGA材料中制成DCR-PLGA微球，360 h內(nèi)Q為（73.08±5.33）%，具有較好的緩釋作用，為DCR關(guān)節(jié)腔注射給藥提供了一種新的思路。

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（收稿日期：2018-01-24 修回日期：2018-04-29）

（編輯：陳 宏）