白鳳 董玉 李斌鑫 趙海龍

摘 要 目的：建立同時測定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Elite C18，流動相為0.5%磷酸-乙腈（梯度洗脫），流速為0.6 mL/min，檢測波長為235 nm（高良姜素、高良姜素-3-甲醚）、420 nm（雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素），柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.047 2～0.472 0 μg（r=0.999 9）、0.104 0～1.040 0 μg（r=0.999 9）、0.030 4～0.304 0 μg（r=0.999 9）、0.039 2～0.392 0 μg（r=0.999 8）、0.232 0～2.320 0 μg（r=0.999 7）；定量限分別為11.41、12.73、4.92、5.29、5.39 ng，檢測限分別為3.41、3.72、1.46、1.59、1.62 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于3%；加樣回收率分別為97.24%～102.93%（RSD=2.01%，n=6）、95.10%～101.50%（RSD=2.34%，n=6）、95.23%～97.61%（RSD=0.97%，n=6）、97.10%～100.65%（RSD=1.24%，n=6）、 98.69%～101.15%（RSD=0.99%，n=6）。結(jié)論：該方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量的同時測定。

關(guān)鍵詞 蒙藥；復(fù)方協(xié)日嘎-4；高良姜素；高良姜素-3-甲醚；雙去甲氧基姜黃素；去甲氧基姜黃素；姜黃素；高效液相色譜法；含量測定

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1964-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.21

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of galangin， galangin-3-methyl ether， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin in mongolian medicine Xieriga-4. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Elite C18 column with mobile phase consisted of 0.5% phosphoric acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelengths were set at 235 nm （galangin， galangin-3-methyl ether） and 420 nm （bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin）. The column temperature was set at 25 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of galangin， galangin-3-methyl ether， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin were 0.047 2-0.472 0 μg（r=0.999 9）， 0.104 0-1.040 0 μg（r=0.999 9）， 0.030 4-0.304 0 μg（r=0.999 9），0.039 2-0.392 0 μg（r=0.999 8）， 0.232 0-2.320 0 μg（r=0.999 7）， respectively. The limits of quantitation were 11.41， 12.73， 4.92， 5.29， 5.39 ng； the limits of detection were 3.41， 3.72， 1.46， 1.59， 1.62 ng， respectively， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 3%. The recovery rates were 97.24%-102.93%（RSD=2.01%，n=6）， 95.10%-101.50%（RSD=2.34%，n=6）， 95.23%-97.61%（RSD=0.97%，n=6）， 97.10%-100.65%（RSD=1.24%，n=6）， 98.69%-101.15%（RSD=0.99%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and reproducible. It can be used for simultaneous determination of galangin， galangin-3-methyl ether， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin in mongolian medicine Xieriga-4.

KEYWORDS Mongolian medicine； Xieriga-4； Galangin； Galangin-3-methyl ether； Bisdemethoxycurcumin； Demethoxycur- cumin； Curcumin； HPLC； Content determination

蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4是蒙醫(yī)臨床治療泌尿系統(tǒng)感染的常用處方[1]，該處方收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》[2]中，由姜黃、黃柏、梔子、蒺藜等4味藥材按配伍原則以5 ∶ 3 ∶ 4 ∶ 5（質(zhì)量比）組成，具有利尿、清泄?jié)駸岬裙π?，主要用于小便閉止、尿頻、尿急、尿中帶血、膀胱刺痛等癥[1]。從該復(fù)方中分離得到的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素等姜黃素類成分已被證實是姜黃中具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用的主要有效成分[3-8]；高良姜素、高良姜素-3-甲醚是從該復(fù)方姜黃藥材中首次分離得到的化合物，已有研究表明高良姜素具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗菌和抗過敏等[9]。

本課題組前期對復(fù)方協(xié)日嘎-4的化學(xué)成分、質(zhì)量控制進(jìn)行了初步研究[10-13]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定該復(fù)方中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素5種成分含量的方法，旨在為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀，包括化學(xué)工作站、二元泵、內(nèi)置真空脫氣機(jī)、柱溫箱、輸液泵、手動進(jìn)樣器、紫外檢測器（美國Agilent公司）；AB135-S型電子分析天平（美國Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方協(xié)日嘎-4（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制，編號：S1-S15）；高良姜素-3-甲醚對照品（上海穎心實驗室設(shè)備有限公司，批號：20170919001，純度：99.8%）；高良姜素對照品（批號：111699-200501，純度：98.5%）、雙去甲氧基姜黃素對照品（批號：112004-201501，純度：95.0%）、去甲氧基姜黃素對照品（批號：112003-201501，純度：98.5%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；姜黃素對照品（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號：MUST-17050310，純度：98.9%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4制備所用各味藥材均經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李驍副教授鑒定為真品，藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Elite C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.5%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，36%→37% A；10～40 min，37%→38% A；40～50 min，38%→41% A；50～60 min，41% A）；流速：0.6 mL/min；檢測波長：235 nm（高良姜素、高良姜素-3-甲醚）、420 nm（雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰形尖銳、對稱性好；供試品中上述5種成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，均達(dá)到基線分離，理論板數(shù)以高良姜素峰計應(yīng)不低于14 000，陰性對照對測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取高良姜素對照品1.18 mg、高良姜素-3-甲醚對照品1.30 mg、雙去甲氧基姜黃素0.76 mg、去甲氧基姜黃素0.98 mg，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，得單一對照品貯備液。精密稱取姜黃素對照品0.58 mg，精密吸取上述高良姜素對照品貯備液0.5 mL、高良姜素-3-甲醚對照品貯備液1 mL、雙去甲氧基姜黃素對照品貯備液0.5 mL、去甲氧基姜黃素對照品貯備液0.5 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，得高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素質(zhì)量濃度分別為0.023 6、0.052 0、0.015 2、0.019 6、0.116 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品約10 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容。將上述濃縮后的復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品提取液加入大孔吸附樹脂柱經(jīng)水洗脫，棄去洗脫液，加入95%乙醇洗脫，回收溶劑并濃縮洗脫液，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按復(fù)方協(xié)日嘎-4處方，制備缺姜黃藥材的陰性樣品（精密稱取黃柏約1.6 g、梔子約2.4 g、蒺藜約3.0 g，依法操作），按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分檢測進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表 2。

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的定量限分別為11.41、12.73、4.92、5.29、5.39 ng，檢測限分別為3.41、3.72、1.46、1.59、1.62 ng。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下同一供試品溶液（編號：S1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積的RSD分別為0.73%、0.22%、0.38%、0.67%、1.06%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下同一供試品溶液（編號：S1）6份，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積的RSD分別為1.54%、0.51%、0.50%、1.12%、0.74%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品（編號：S1）約10 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的平均含量分別為0.001 2%、0.002 1%、0.002 9%、0.001 4%、0.005 9%，RSD分別為2.92%、2.89%、2.61%、2.25%、2.23%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品（編號：S1）5 g，共6份，分別加入一定量的5種成分對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

分別取15批復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 測定成分的選擇

本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[14]，篩選出復(fù)方協(xié)日嘎-4中所含的部分有效成分，并將其與前期分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行對比分析，最終確定以高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素為測定成分，以完善其質(zhì)量控制。

3.2 檢測波長的選擇

本試驗在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高良姜素和高良姜素-3-甲醚在254 nm波長附近吸收較好。本試驗又分別比較了235、254、280 nm波長的檢測結(jié)果，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)檢測波長為235 nm時高良姜素和高良姜素-3-甲醚的分離度較好，故選擇235 nm為高良姜素、高良姜素-3-甲醚的檢測波長。2015年版《中國藥典》（一部）中姜黃素的檢測波長為430 nm[15]，筆者結(jié)合本試驗發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素在420 nm波長處分離較好，且干擾少，故選擇420 nm為這3種成分的檢測波長。

3.3 流動相的選擇

本試驗考察了0.5%乙酸-甲醇、0.5%磷酸-甲醇、0.5%乙酸-乙腈、0.5%磷酸-乙腈和0.2%磷酸-乙腈5種不同組成及比例的流動相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素采用含甲醇的流動相時分離度較差，而采用含乙腈的流動相時分離度較好，故選擇含乙腈的流動相[16]。又通過比較發(fā)現(xiàn)，流動相中加入磷酸分離度較好，且磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高分離度越好[17]，故最終選擇0.5%磷酸-乙腈（梯度洗脫）為流動相。在此條件下，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素均能達(dá)到基線分離，且峰形較好。

3.4 流速的選擇

流速是色譜條件中的重要因素，流速增加可使樣品分析時間縮短，但流速過快又會使樣品組分的分離效果變差。本試驗分別考察了0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min 4個流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速為0.6 mL/min時，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的分離度均較好且分析時間較短，故最終選擇0.6 mL/min為流速。

綜上所述，本方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于同時測定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素5種成分的含量。

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（收稿日期：2018-02-23 修回日期：2018-05-17）

（編輯：陳 宏）