筱 禾 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

作為農(nóng)業(yè)害蟲和人類疾病媒介的昆蟲可引起嚴重的經(jīng)濟損失，而且每年造成100～300萬人死亡。真菌是自然界最常見的昆蟲病原菌，已知有 1 000多種。由于真菌的主要生活方式之一——昆蟲致病性尚有很大部分未經(jīng)探索，可能還有更多仍有待于鑒定。真菌通常會引起流行病爆發(fā)，可使昆蟲數(shù)量減少90%以上。此類情況多見于毛蟲、蚜蟲、甲蟲甚至家蠅。一個多世紀以來，科學家們一直熱衷于利用這些病原體作為生物控制劑來防治傳播植物病毒病的蚜蟲以及傳播瘧疾的蚊子等農(nóng)業(yè)害蟲和病媒種群。與細菌和病毒不同，作為觸殺型殺蟲劑的真菌可直接穿透昆蟲表皮，這使它們尤其適合于開發(fā)生物殺蟲劑。昆蟲病原真菌侵染和發(fā)育過程的關(guān)鍵階段為：孢子附著于昆蟲表皮，孢子萌發(fā)，膨大“吸附器”(附著胞)的分化，表皮穿透，血腔定殖和孢子形成，之后出現(xiàn)染病蟲尸。在真菌侵染過程中，昆蟲自身的強大抗菌防御作用成為昆蟲致病性進化的屏障：具有廣泛寄主范圍的非專化性昆蟲病原菌相對較少。但可能有成千上萬的特異物種已經(jīng)進化，能“解開”單一昆蟲物種或幾個極近緣昆蟲物種的“鎖”。由于這些真菌通常很難人工培養(yǎng)，因此對它們克服寄主的防御共同進化的機制知之甚少。系統(tǒng)發(fā)育學研究表明，盡管昆蟲病原的侵入和發(fā)育過程大致相似，但昆蟲致病性代表了生存方式的適應(yīng)性，這在真菌綱所有主要門中通過趨同進化而獨立且頻繁重復出現(xiàn)。因此，各主要類群在寄主范圍、致病策略和分子機制等方面存在顯著差異。如子囊菌的寄主范圍通常較廣，病菌可產(chǎn)生毒素殺死寄主，而昆蟲病原真菌通常是通過在昆蟲體內(nèi)破壞性生長特異性殺死寄主，寄主范圍較窄。但即使是同屬肉座菌目(Hypocreales)的親緣子囊菌，如綠僵菌和白僵菌，它們用來黏附寄主、穿透寄主表皮和克服寄主防御的蛋白質(zhì)也各不相同。它們提供了可組合于單個病原體載體中的大量基因，使環(huán)境持久性和毒性最大化。昆蟲病原真菌具有高度的特異性，對環(huán)境安全，通常毒性極強，可引起大范圍昆蟲流行病。然而，它們中的大多數(shù)難以人工培養(yǎng)，因此更易用于典型生物防治方案，而不是作為廣泛使用的殺菌劑(mycobiocides)。人們聚焦于開發(fā)肉座菌目真菌作為生物防治劑，因為它們的寄主范圍相對較廣，而且易于大規(guī)模生產(chǎn)。目前市面上大約80%的昆蟲病原真菌產(chǎn)品是基于綠僵菌屬和白僵菌屬的。綠僵菌和白僵菌均天然存在于世界各地不同生境的土壤中。它們具有根際能力，可以內(nèi)生菌的形式存在并表現(xiàn)出“菌根”特征，將氮從受感染的昆蟲轉(zhuǎn)移到寄主植物，從而提取光合產(chǎn)物碳。尚不清楚這些真菌究竟如何進化以殺死節(jié)肢動物(昆蟲、蜱和螨蟲)，盡管假設(shè)它們起初為植物共生體，它們的寄主范圍擴大到可利用昆蟲作為氮源來保持互惠共生的植物內(nèi)共生。各菌株已經(jīng)明顯地對昆蟲產(chǎn)生了不同程度的特異性和毒力，但它們共同靶向大多數(shù)昆蟲，包括鞘翅目、半翅目以及罕見發(fā)生細菌或病毒病的直翅目昆蟲。

隨著工業(yè)生產(chǎn)自動化的成功，綠僵菌商業(yè)化的成本與傳統(tǒng)化學殺蟲劑相當。盡管如此，因為真菌病原體不穩(wěn)定的田間表現(xiàn)和低毒力(即殺滅速度緩慢和接種量需求高)已將大部分市場讓給了它們的化學競爭者。正如殺滅速度緩慢可能是許多病原體的天然劣勢一樣，低毒力可能也是內(nèi)在的，特別是如果它與抑制產(chǎn)孢具有相關(guān)性。寄主范圍狹窄的綠僵菌的殺滅速度緩慢，如蝗蟲特異性蝗綠僵菌(Metarhizium acridum)，這與在活體寄主內(nèi)生長時優(yōu)化利用營養(yǎng)物的策略相關(guān)。在這些情況下，經(jīng)濟有效的生物防治將需要對真菌進行遺傳修飾，以提高低孢子劑量的殺滅速度。田間效果的不一致性主要是由于昆蟲病原真菌對環(huán)境脅迫，特別是紫外線的敏感性所致。

基因工程結(jié)合對真菌致病機制和生態(tài)學的深入理解，通過增強真菌對環(huán)境脅迫的耐受性及其毒力，為提高真菌殺蟲劑的功效和經(jīng)濟有效性提供了無數(shù)的機會。本文綜述了這個新興領(lǐng)域中一些最有發(fā)展前景的方面，討論了引起菌株演變的途徑：⑴ 增加角質(zhì)層降解，更快侵入寄主；⑵ 經(jīng)由殺蟲毒素的表達使昆蟲迅速停止取食并被麻痹；⑶ 改造限定昆蟲寄主范圍；⑷ 增加對非生物脅迫的抗逆性；⑸ 切斷傳播人類病原體的能力。

1 昆蟲病原真菌基因工程方法

昆蟲病原真菌生產(chǎn)商希望得到殺滅速度快、寄主范圍廣且在不同環(huán)境條件下都能發(fā)揮作用的菌株，即與化學殺蟲劑藥效相當?shù)木?。傳統(tǒng)的提高病原菌功效的方法一般是建立在生產(chǎn)過程中對真菌進行生理調(diào)控，或者開發(fā)更好的劑型和應(yīng)用方案的基礎(chǔ)上。在這些領(lǐng)域會繼續(xù)發(fā)展。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化在綠僵菌和白僵菌中已很高效。利用農(nóng)桿菌插入誘變技術(shù)對羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robertsii)進行全基因組功能篩選，發(fā)現(xiàn)了與產(chǎn)孢和毒力增強相關(guān)的基因。近期已利用成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(CRISPR)-Cas 9(CRISPR相關(guān)蛋白9)方法對白僵菌進行了改良，其他昆蟲病原真菌必將很快跟進應(yīng)用此法。

2 基因工程增強毒力

提高毒力基因工程的重點是縮短殺死時間[即縮短致死時間(LT50)，圖1]和降低所需的致死分生孢子劑量[即降低真菌的致死劑量(LD50)，圖 2]。致命侵染所需真菌量的降低實現(xiàn)了經(jīng)濟有效的防治，提高了田間持效性。因此，盡管分生孢子活力會隨著時間的推移而下降，但昆蟲仍可能接觸到超過致死閾值的基因工程真菌繁殖體。通過改造昆蟲病原真菌表達靶向寄主角質(zhì)層的內(nèi)源蛋白，靶向激素和昆蟲生理的昆蟲蛋白，來自昆蟲天敵和其他昆蟲病原體的神經(jīng)毒性肽以及合成基因，已經(jīng)實現(xiàn)了毒力增強(圖3)。這些測試的轉(zhuǎn)基因使寄主的存活時間縮短了 19%～43%(圖 1)。

2.1 利用昆蟲病原真菌本身作為菌株改良基因來源

不同昆蟲病原菌的致病性獨立進化，有許多因素影響毒力。因此，盡管角質(zhì)層侵入和逃避寄主免疫系統(tǒng)可能必然是致病性的共同特性，但獨立進化的病原體會以不同的方式達到這些目標。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹蟲草(Cordyceps militaris)和幾種綠僵菌的完整序列正在揭示昆蟲致病性的趨同進化和寄主轉(zhuǎn)換現(xiàn)象的機制。已證明對階段特異性基因表達和調(diào)節(jié)真菌寄主范圍的信號轉(zhuǎn)導途徑的精細表征對成功開發(fā)具有毒力增強的轉(zhuǎn)基因生物殺蟲劑極有價值。

圖1 由轉(zhuǎn)化到昆蟲病原真菌基因組中的基因所產(chǎn)生的LT50改良

2.1.1 利用天然酶穿透昆蟲角質(zhì)層

角質(zhì)層降解酶由單個基因編碼，易于進行基因轉(zhuǎn)移，因此是基因工程增強毒力的令人關(guān)注的初步候選物。昆蟲角質(zhì)層主要由嵌入蛋白質(zhì)基質(zhì)中的幾丁質(zhì)原纖維組成。真菌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶是大基因家族的產(chǎn)物，對角質(zhì)層溶解有增效作用。具有獨特活性譜的多基因產(chǎn)物增加了天然可用于開發(fā)生物技術(shù)方法的工具的范圍和精度。此外，這些酶還具有與相關(guān)腐生菌產(chǎn)生的類似蛋白質(zhì)不同的致病特異性。例如，由于羅伯茨綠僵菌枯草桿菌蛋白酶 Pr1表面帶正電荷的氨基酸的較強結(jié)合有助于增加其對角質(zhì)層的活性。與腐生菌產(chǎn)生的類似蛋白酶相比，它的活性提高了33倍。即使在模擬昆蟲防御反應(yīng)的快速黑化環(huán)境中，Pr1也對蛋白酶抑制劑具有抗性。

大多數(shù)這些基因的表達受到嚴格調(diào)控，因此酶僅在其底物存在時產(chǎn)生，避免產(chǎn)生被寄主免疫系統(tǒng)識別為外源的蛋白質(zhì)。第一種具有增強毒力的重組病原體組成型過表達角質(zhì)層降解蛋白酶。構(gòu)建該轉(zhuǎn)基因菌株以確定對寄主角質(zhì)層的進一步破壞是否有助于寄主昆蟲體內(nèi)的真菌擴展并提高殺滅速度。但在煙草天蛾(Manduca sexta)體內(nèi)的羅伯茨綠僵菌Pr1組成型表達激活了寄主蛋白酶，其反過來引發(fā)體腔中的大量黑化，導致存活時間減少 25% (LT50)，而不是有利于真菌擴展。后來發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)血淋巴中的一種免疫相關(guān)蛋白酶(Persephone)可特異性地引發(fā)對類Pr1真菌蛋白酶的免疫應(yīng)答。這可能解釋了為什么野生型羅伯茨綠僵菌一旦穿透昆蟲角質(zhì)層進入血淋巴就停止表達蛋白酶基因。即使采用單個生物體時，基因工程研究也可能無法實現(xiàn)預期的效果，如本例所示，病原體的效果可能極難預測，因為寄主和病原體間可能存在無法預料的相互作用。但被轉(zhuǎn)基因菌株殺死的大量黑化昆蟲不利于真菌生長和孢子形成，減少了重組真菌的傳播。這有助于美國環(huán)保署批準對羅伯茨綠僵菌 Pr1過表達菌株進行田間試驗，從而為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。該試驗也是在羅伯茨綠僵菌中首次采用綠色熒光蛋白(GFP)標記，借助熒光標簽偶然發(fā)現(xiàn)該菌具有根際能力。

圖2 由轉(zhuǎn)化到昆蟲病原真菌基因組中的基因所產(chǎn)生的LC50改良

圖3 毒力增強圖解：修飾昆蟲病原菌以增加毒力的主要方法

構(gòu)建過量生成球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶CHIT1使寄主存活時間下降了23%，即與Pr1的作用類似。羅伯茨綠僵菌 Pr1A的表達也可提高球孢白僵菌的殺滅速度，表明來自一種昆蟲病原真菌的致病相關(guān)基因可用于增強其他昆蟲病原真菌的毒力。也測試了角質(zhì)層降解酶組合，發(fā)現(xiàn)具有增效性，在某些情況下可增強毒力。一株基因工程球孢白僵菌類Pr1蛋白酶BbCDPE1(球孢白僵菌類Pr1蛋白酶)和幾丁質(zhì)酶CHIT1同時過表達菌株對殺滅時間和致死劑量的降低，明顯大于各自單獨表達。

2.1.2 設(shè)計合成來自昆蟲病原真菌的基因

通過合成生物學，科學家們可以突破自然存在的蛋白質(zhì)序列：可進一步創(chuàng)造雜交其他基因中發(fā)現(xiàn)的活性或者具有從未在自然界中進化過的新功能的雜交基因。角質(zhì)層是合成蛋白質(zhì)工程方法的第一個目標。白僵菌含有類Pr1A蛋白酶CDEP1和幾丁質(zhì)酶Bbchit1的融合蛋白CDEP1︰Bbchit1的表達促進了對昆蟲角質(zhì)層的穿透，其程度大于單獨 Pr1A或Bbchit1過表達。據(jù)推測，這種效應(yīng)是由于角質(zhì)層蛋白的蛋白酶解暴露出幾丁質(zhì)，然后附帶的幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用所致。

昆蟲基因的功能結(jié)構(gòu)域與昆蟲病原體基因的融合可以產(chǎn)生具有新穎增強作用的蛋白質(zhì)。球孢白僵菌的幾丁質(zhì)酶 Bbchit1缺少典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)構(gòu)建了幾種Bbchit1與源于植物、細菌和昆蟲的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的球孢白僵菌雜種幾丁質(zhì)酶。Bbchit1與源于家蠶(Bombyx mori)幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合表明，與幾丁質(zhì)和昆蟲角質(zhì)層結(jié)合的性能提高最多，其在白僵菌中的表達導致寄主昆蟲比感染過表達天然幾丁質(zhì)酶真菌的更快地死亡。與野生型菌株以及過表達單一天然蛋白酶的菌株相比，家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與類Pr1A蛋白酶 BbCDEP1結(jié)合幾丁質(zhì)的融合從昆蟲角質(zhì)層中釋放出更多的肽，顯著增強了球孢白僵菌的毒力。綠僵菌和白僵菌非常適合轉(zhuǎn)化，它們可以作為基因改組(gene shuffling)的模型系統(tǒng)，尤其適用于篩選新的效應(yīng)子或合成基因。一旦表征，最佳候選者就可以通過昆蟲或植物等試驗較少易于處理的系統(tǒng)來實現(xiàn)。

2.1.3 增強血淋巴養(yǎng)分

昆蟲病原真菌必須合成不同類別的酶，以穿透角質(zhì)層進而在血淋巴中增殖，它們能利用碳水化合物?；染G僵菌分泌一種可利用海藻糖的海藻糖酶(酸性海藻糖酶綠僵菌1或ATM1)，海藻糖是大多數(shù)昆蟲血淋巴中的主要糖類。ATM1的過表達加速了蝗蟲血腔中蝗綠僵菌的生長，其LC50是野生型菌株的1/8甚至更低。因此，增強昆蟲病原真菌利用寄主營養(yǎng)的方法是提高毒力的一種可行方法。

2.1.4 改變寄主范圍

最近對控制昆蟲病原真菌的寄主特異性的分子機制的深刻了解已能表征寄主范圍相關(guān)基因。對越來越多的昆蟲病原體測序基因組的研究將能表征全部致病性和寄主特異性相關(guān)基因。通過了解這些基因的功能，有可能創(chuàng)造兼具昆蟲特異性和毒力增強的昆蟲病原真菌。這種研究方法的潛力已經(jīng)展現(xiàn)出來了。將一個酯酶基因(綠僵菌酯酶1或Mest1)從多寄主的羅伯茨綠僵菌轉(zhuǎn)移到蝗蟲特異性蝗綠僵菌中，可使后者的宿主范圍擴大，包括毛蟲。

2.2 寄主昆蟲蛋白在昆蟲病原真菌中表達

2.2.1 基因工程寄主向病原菌基因轉(zhuǎn)移

水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer)的全基因組分析顯示，綠僵菌已獲取了來自其他微生物(如細菌和古細菌)，甚至其他真核生物(如節(jié)肢動物、植物和脊椎動物)的多種組合。例如，從昆蟲獲得的一個甾醇轉(zhuǎn)運體(羅伯茨綠僵菌 Neimann-Pick C2型或Mr-NPC2a)，可使真菌與寄主競爭血淋巴中的生長限制性甾醇。通過將甾醇載體基因轉(zhuǎn)移到缺少內(nèi)源Mr-NPC2a同源物的球孢白僵菌中來復制該進化，從而提高其致病性。

2.2.2 利用寄主內(nèi)環(huán)境平衡(homeostasis)

在水平獲取Mr-NPC2a發(fā)現(xiàn)報道之前，已構(gòu)建了幾種表達其寄主昆蟲自身分子的重組真菌。利尿激素調(diào)節(jié)昆蟲水/鹽平衡；煙草天蛾利尿激素(MSDH)的表達顯著增加了球孢白僵菌對鱗翅目害蟲和黃熱病傳播媒介蚊子的毒力。一個重要免疫相關(guān)信號通路(Toll信號通路)的抑制性調(diào)節(jié)因子的表達也增加了球孢白僵菌對蠟螟(Galleria mellonella)和桃蚜成蟲(Myzus persicae)的毒力。因此，使一個在昆蟲體內(nèi)正常無活性的分類學保守分子偶爾具有活性可增加昆蟲病原真菌對各種昆蟲的毒力。反之，利用對靶標昆蟲特異的分子可以特異性地增加昆蟲病原真菌對這些昆蟲的毒力。胰蛋白酶調(diào)節(jié)抑制(“卵巢抑制”)因子(TMOF)抑制胰蛋白酶的合成，胰蛋白酶用于蚊子吸血后消化腸道中的食物。來自埃及伊蚊的TMOF在球孢白僵菌中的表達使對成蟲和幼蟲的殺滅速度加快，但對麻蠅(Sarcophaga bullata)無此效果。推測昆蟲間不同的TMOF序列是基因工程球孢白僵菌寄主范圍較窄改善的原因。類似地，在球孢白僵菌中表達來自火蟻(Solenopsis invicta)的種特異性的焦激肽(pyrokinin)β-神經(jīng)肽可更快殺死火蟻，但對鱗翅目昆蟲無效。

目前利用的增加昆蟲病原真菌毒力的昆蟲分子涉及5個生化過程：甾醇凝血、滲透平衡、食物消化、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能。從理論上講，昆蟲的任何生化過程都可能成為被破壞的靶標；因此，可以利用組合不同的昆蟲分子的昆蟲生物學，來構(gòu)建對靶標害蟲具有高度特異性的更具毒力的真菌菌株。

2.3 來自昆蟲天敵和其他昆蟲病原菌的基因的表達

2.3.1 將節(jié)肢動物源毒素轉(zhuǎn)入昆蟲病原真菌

編碼從蜘蛛和蝎子分離的昆蟲特異性毒素的各種基因已被引入到綠僵菌或白僵菌的基因組中。這些毒素通常通過靶向一個或多個主要離子通道(例如Na+，K+，Ca+和Cl-)而使昆蟲出現(xiàn)快速麻痹，從而產(chǎn)生一些殺蟲迅速的重組真菌。

早期受到關(guān)注的是蝎子興奮性鈉通道阻斷劑AaIT1。將 AaIT1[黃肥尾蝎(Androctonus australis)昆蟲毒素]基因插入寄主范圍廣泛的金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株(ARSEF 549)中，可使對多種昆蟲的殺滅時間減少 40%，致死劑量(孢子)減少至 1/9～1/22。類似地，將來自東亞鉗蝎[Buthus martensi(Karsch)]的蝎毒素 BmKit(東亞鉗蝎昆蟲毒素)基因插入另一種寄主范圍廣泛的昆蟲病原真菌蠟蚧輪枝菌(Lecanicillium lecanii)，使致死劑量減少至1/7.1，半數(shù)存活時間減少26.5%。在一些情況下，寄主死亡速度快，相應(yīng)的蟲尸上子代分生孢子的量下降，這可能是由于死亡前寄主血腔中的菌絲體生長減少了。因此，節(jié)肢動物毒素賦予的加快殺滅速度與真菌繁殖可能互為消長。但不同寄主對分生孢子產(chǎn)量的影響不一致，表明毒素表達對真菌繁殖的影響可能取決于真菌種類和毒素。

諸如金龜子綠僵菌和蠟蚧輪枝菌等廣寄主菌提供了用于生物測定毒素對多種害蟲作用的合適載體，但出于安全和監(jiān)管要求，須對非靶標生物無風險的特定菌株才可應(yīng)用。此外，專家可以特別受益于這項技術(shù)，因為它們通常會更慢地殺死。例如，使用蝗綠僵菌的缺點是蝗蟲從侵染到死亡需要幾天時間。這需要防止應(yīng)用于跳蝻(蝗蟲若蟲)的真菌超過防治經(jīng)濟閾值。利用來自黑背以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus hebraeus)的LqhIT2(黑背以色列金蝎昆蟲毒素)和來自朱迪亞黑蝎 Buthotus judaicus的BjαIT(Buthotus judaicus昆蟲毒素)提高了蝗綠僵菌的毒力。除了AaIT1，還有來自漏斗網(wǎng)蜘蛛Hadronyche versuta和Atrax robustus的幾種編碼昆蟲特異性毒素的基因也被插入蝗綠僵菌中，包括 κ-HXTX-Hv1c(hexatoxin-high voltage activated 1c；Ca2+激活 K+通道的抑制劑)、混合毒素[阻斷CaV和KCa通道的自增效(self-synergizing)肽毒素]和ω-HXTX-Hv1a(昆蟲電壓門控鈣通道的阻斷劑)。4種神經(jīng)毒素都通過減少致死劑量、殺滅時間和取食來提高蝗綠僵菌對蝗蟲的藥效，毒素聯(lián)用顯示增效作用，改善毒性效應(yīng)，包括取食減少 78%。但重組菌株保留了寄主特異性，對非蝗蟲類不致病：這可能是因為特異性主要取決于空間和時間上與轉(zhuǎn)基因表達分離的表皮層的反應(yīng)。

應(yīng)用發(fā)展最迅速的是針對疾病媒介的真菌。瘧疾是致死率最高的媒介傳播疾病，每年造成120多萬人死亡，其中大多數(shù)是5歲以下的非洲兒童。一株防治蚊子的寄主專一性平沙綠僵菌(Metarhizium pingshaense)菌株的毒力通過同時表達AaIT1和混合毒素得到了極大的提高。然而，即使是單獨表達混合毒素的平沙綠僵菌，感染5 d后也會使攝食活性(進而傳播可能)減少 60%以上?？紤]到轉(zhuǎn)基因昆蟲病原體造成的死亡率，不足20%的蚊子存活，在感染5 d后尋找寄主，超過了世界衛(wèi)生組織(WHO)判定一項成功的病媒防治技術(shù)所設(shè)的閾值。

蜘蛛毒液中的大部分肽用于麻痹獵物，其他肽則具有抗菌作用，可能是用于防治蜘蛛在吸食獵物體液時遇到的傳染性微生物。帝王蝎(Pandinus imperator)抗菌scorpine與昆蟲抗菌天蠶素(cecropins)和防御素相似，但它對伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)的效力比后者高100倍。眾所周知，蚊子易于對防治藥劑出現(xiàn)抗性，但使用殺滅速度緩慢的綠僵菌菌株(使蚊子的產(chǎn)卵量減少)可以減輕對蚊子的選擇壓力，減緩對生物農(nóng)藥的抗藥性進化。一株表達scorpine或scorpine與唾液腺結(jié)合的SM1(唾液腺和中腸肽 1)肽的融合蛋白的金龜子綠僵菌菌株可使感染性瘧原蟲的數(shù)量減少97%以上。

2.3.2 利用細菌性毒素增加毒力

在另一個相關(guān)的研究方法中，昆蟲致病細菌和病毒也被作為具新穎作用機制的毒素的來源。來源于蘇云金桿菌(Bt)的昆蟲特異性毒素作用于靶標昆蟲的中腸上皮組織。因此，在角質(zhì)層或體腔內(nèi)真菌遞送Bt毒素不會增強殺蟲效力。Bt營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vip)Vip3A的表達沒有增強寄主表皮應(yīng)用的球孢白僵菌分生孢子的侵染性，但是與野生型菌株相比，轉(zhuǎn)化體在被攝取后有致死效應(yīng)。這種雙重作用機制的優(yōu)點是可以角質(zhì)層侵染和經(jīng)口毒性結(jié)合殺死昆蟲。一項田間試驗表明，重組菌株的防效與類似化學藥劑相當，且對非靶標節(jié)肢動物無不利影響。

3 避免非生物脅迫

3.1 預防紫外線(UV)損傷

真菌源殺蟲劑的田間效果通常受限于其對非生物脅迫(如UV輻射和溫度)的敏感性。加速生長篩選已經(jīng)成功用于鑒定金龜子綠僵菌紫外誘導突變體的抗逆性和超強毒力。然而，已應(yīng)用基因工程技術(shù)來提高對環(huán)境脅迫的耐受性，以生成在不同條件下作用穩(wěn)定、持效期長的產(chǎn)品。紫外線輻射是暴露于光照的真菌源農(nóng)藥(如應(yīng)用于葉部藥劑)最具挑戰(zhàn)性的環(huán)境因子。紫外線輻射主要通過誘導堿基化學修飾來破壞 DNA，其中大多數(shù)是環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)。這些光損傷主要通過羅伯茨綠僵菌的光復活作用消除。但其天然CPD光裂合酶不足以抵抗由7 h太陽輻射引起的CPD損傷和預防活力損失。非常耐紫外線的嗜鹽菌(Halobacterium)光解酶的表達使羅伯茨綠僵菌和球孢白僵菌的光照存活率提高了 30倍以上。與野生型菌株不同，表達嗜鹽菌光裂合酶的羅伯茨綠僵菌或球孢白僵菌暴露于光照下幾小時后仍對岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)具有毒力。

除了直接損傷DNA外，紫外線輻射還通過產(chǎn)生反應(yīng)性氧化物(ROS)來提高氧化應(yīng)激反應(yīng)。超氧化物歧化酶(SOD)過表達增強了球孢白僵菌對 ROS的解毒能力，增強了對紫外線的耐受性。類似地，細菌大腸桿菌(Escherichia coli)硫氧還蛋白(trxA)的表達提高了球孢白僵菌對UV-B輻射、氧化和熱的耐受性。

分生孢子細胞表面的色素充當真菌細胞免受紫外線傷害的保護層，但球孢白僵菌不產(chǎn)生可見色素。煙曲霉(Aspergilllus fumigatus)酪氨酸酶的表達激活了球孢白僵菌色素的生成，使分生孢子對紫外線輻射的耐受性增強了。羅伯茨綠僵菌分生孢子的細胞壁呈深綠色，但并非是可增強許多其他真菌的紫外線耐受性的二羥基萘-黑色素(DHN-黑色素)。交鏈格孢菌(Alternaria alternata)的DHN合成途徑轉(zhuǎn)入金龜子綠僵菌后，菌株對紫外線輻射的耐受性加倍。該途徑還增強了對熱(35 ℃)和低水分活度(水分活度=97.1%)的耐受性，表明黑色素可使生物對多種非生物脅迫均有耐受性。更令人驚訝的是，DHN-黑色素增強了金龜子綠僵菌對昆蟲的毒力，孢子萌發(fā)和附著胞(侵染結(jié)構(gòu))形成加速，毒性基因表達增加。據(jù)推測，毒力的增加是由于真菌在昆蟲體內(nèi)的抗逆性增強所致。DHN-黑色素合成途徑相關(guān)基因也可能參與侵染過程。參與羅伯茨綠僵菌分生孢子色素合成的漆酶基因也有助于附著胞細胞壁剛性，從而它們產(chǎn)生的膨脹壓力促進角質(zhì)層滲透。

3.2 增強耐熱性

極端溫度也會影響害蟲防治劑的有效性，在全球變暖的時代，如果害蟲比它們的一些天敵適應(yīng)性更強，這可能成為更大的影響因素。與紫外線輻射一樣，熱脅迫會產(chǎn)生ROS。小熱休克蛋白(HSPs)也賦予許多生物體耐熱性，熱脅迫下過量表達HSP25的羅伯茨綠僵菌在昆蟲體內(nèi)的生長增加。在一種明顯不同的方法中，將羅伯茨綠僵菌暴露于遞增熱脅迫連續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生耐熱變體，其在37 ℃下生長良好，同時保持野生型的致病性等級。這表明試驗進化(experimental evolution)為開發(fā)新的害蟲治理方案提供了空間。但由于昆蟲和哺乳動物的真菌病原體破壞蛋白質(zhì)外殼和避開寄主天然免疫系統(tǒng)的侵染策略非常相似，因此采用在人體溫下可以繁殖的昆蟲病原體需慎重考慮。

4 靶基因在基因工程昆蟲病原真菌中的表達

在開發(fā)一種生物體作為基因工程項目的載體時，有意地調(diào)節(jié)同源和異源基因的表達是一個重要的目標。這可以通過積累綁定RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子(啟動子)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的DNA片段的工具箱來實現(xiàn)?；蚬こ坛跗冢愒椿蛟跇?gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GPDA)等強組成型啟動子控制下在金龜子綠僵菌中表達。后來發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌和蝗綠僵菌 GPD基因的天然啟動子在它們各自的物種中比構(gòu)巢曲霉 GPD啟動子的活性明顯更強。一種具有更強活性的天然啟動子是球孢白僵菌 I類疏水蛋白，其在球孢白僵菌的幾乎所有發(fā)育階段均可表達。該啟動子截短的 1290-bp片段甚至具有更強的活性，用于促進上述中腸特異性毒素Vip3A的表達。

發(fā)育期特異性啟動子只在真菌的某些發(fā)育階段促進定向基因表達，可使轉(zhuǎn)基因靶向表達。一個重要的目的是采用受昆蟲相關(guān)信號嚴格控制的啟動子，以確保靶向配置昆蟲特異性毒素。綠僵菌類膠原蛋白MCL1是昆蟲血淋巴中防御吞噬作用所必需的一種高表達基因。利用MCL1啟動子促進轉(zhuǎn)基因表達，確保轉(zhuǎn)基因基因在昆蟲體腔內(nèi)表達，而不是在昆蟲外部表達。MCL1啟動子是目前唯一用于昆蟲病原真菌基因工程的發(fā)育期特異性啟動子。隨著昆蟲體內(nèi)真菌發(fā)育全基因組表征，更多的發(fā)育期特異性啟動子正在被鑒定。例如，上述甾醇載體基因Mr-NPC2A是從T-DNA隨機插入突變體庫分析鑒定而來。從生物工程的角度特別令人感興趣的是，當使用 Mr-NPC2A 啟動子—綠色熒光蛋白(GFP)報告基因融合時，Mr-NPC2A只在活體昆蟲中表達。定位表達不可預測，不篩選防治昆蟲的隨機突變體便不會發(fā)現(xiàn)Mr-NPC2A的作用。這與MCL1啟動子形成對比，后者在體外提取的昆蟲血淋巴中也有表達。

5 對轉(zhuǎn)基因昆蟲病原真菌風險的防范

5.1 轉(zhuǎn)基因昆蟲病原菌生命周期控制

與其他轉(zhuǎn)基因生物一樣，基因工程昆蟲病原真菌也存在安全性問題。作為預防措施，限制重組病原體在田間的持效期和繁殖是一預防措施。為此，已有人提議應(yīng)修飾轉(zhuǎn)基因菌株使其生態(tài)學弱化(ecologically enfeebled)，從而降低對田間本地菌株的競爭力。實現(xiàn)這一目標的研究工作包括敲除內(nèi)源性脅迫防御基因，盡管科學家同時生成其他具有更高抗逆性的菌株。因此，羅伯茨綠僵菌光復活系統(tǒng)的缺失導致對紫外線輻射具有超敏性。UV-超敏性也是超毒力的菌株在防治蚊子尤時為有效，因為這些基因工程菌株不會從施用部位(如蚊子捕捉器或房屋)擴散到環(huán)境中。

對昆蟲病原真菌適應(yīng)環(huán)境的機制有了深入了解，鑒定了許多可用于降低不同環(huán)境中生態(tài)適合度的其他靶標。例如，干擾能使綠僵菌適應(yīng)寒冷的RNA結(jié)合蛋白，將大大降低綠僵菌越冬能力。這將使真菌能夠在整個生長季節(jié)內(nèi)發(fā)揮作用。已證明由球孢白僵菌在寄主死亡后產(chǎn)生的卵孢霉素(oosporein)可抑制細菌性競爭者，使真菌能充分利用寄主蟲尸來獲取營養(yǎng)。因此，卵孢霉素的生物合成的中斷可通過減少蟲尸產(chǎn)孢而減少傳播。一旦表征，可利用卵孢霉素等許多次級代謝物的生物合成途徑來限制真菌病原體的生命周期。

羅伯茨綠僵菌不僅是昆蟲病原體，也作為根際真菌在根系定殖，與植物建立了互惠共生關(guān)系。植物根部特異性黏附素(Metarhizium adhesion 2，MAD2)和寡糖轉(zhuǎn)運體(Metarhizium raffinose Transporter，MRT)等幾種基因?qū)α_伯茨綠僵菌的根際競爭力很重要。破壞這些基因可顯著降低該菌在土壤中的持效性，但不會影響對昆蟲的致病性。用無根際競爭力的菌株作為基因工程的框架提高毒力將會生成在環(huán)境中存活不良的超毒力菌株。參與羅伯茨綠僵菌和植物間互作的還有許多其他基因，同樣可以刪除它們以降低該菌在田間的根際競爭力。

5.2 轉(zhuǎn)基因切除(excision)

不降低轉(zhuǎn)基因菌株競爭優(yōu)勢性的方法是設(shè)計一種轉(zhuǎn)基因一旦發(fā)揮作用就從基因組中選擇性地被切除的系統(tǒng)?；贑re重組酶-loxP位點重組系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因去除方法可用于基因工程昆蟲病原真菌。在羅伯茨綠僵菌中，Cre重組酶的表達能通過吻合法(anastomosis)切除兩側(cè)為 loxP位點的整合轉(zhuǎn)基因。所得菌株不含轉(zhuǎn)基因，僅保留 LoxP識別位點的短DNA片段。該方法的進一步開發(fā)可用于產(chǎn)生最初具超強毒力，但經(jīng)昆蟲寄主一次或多次傳代后恢復到野生型毒力水平的菌株。

6 對轉(zhuǎn)基因昆蟲病原真菌出現(xiàn)抗性的可能性

“昆蟲是否會對生物防治劑產(chǎn)生抗性”是一個常見問題。由于大多數(shù)工程改造生物防治劑的毒力較高，顯而易見寄主產(chǎn)生抗藥性的選擇壓力隨之應(yīng)該更大。最近的一項研究表明，一組188個完全測序的、野生捕獲的黑腹果蠅品系對金龜子綠僵菌的寄主防御出現(xiàn)顯著變化。在來自相同地理區(qū)域的這些品系中觀察到的抗性遺傳變體累積進而出現(xiàn)抗性進化，對生物農(nóng)藥可持續(xù)性具有影響。

通過比較選擇性(耐受)與非選擇性蠟螟幼蟲的防御和脅迫基因研究了抗病性的進化。對球孢白僵菌侵染的反應(yīng)包括將更多資源分配至對抗真菌的主要屏障角質(zhì)層，如增強角質(zhì)層酚氧化酶的表達以及脅迫處理因子(如抗氧化劑)。該反應(yīng)為對球孢白僵菌所特有，因為它并不能阻礙金龜子綠僵菌。類似地，連續(xù)5代煙粉虱(Bemisia tabaci)被Isaria fumerosa侵染，而在此選擇后沒有表現(xiàn)出抗性進化。盡管如此，為了提高真菌效果同時防止或延緩抗性進化，可能需要在同一真菌中含有多個增強毒力的基因，或者采用幾種真菌，每種使用不同作用機制的不同毒素，以提高毒性和加強抗性治理。

7 結(jié) 語

基因工程和合成生物學手段所提供的強大力量克服了限制生物防治劑開發(fā)的對非生物脅迫的低耐受性和低毒力問題。隨著毒力基因和昆蟲弱點的快速發(fā)現(xiàn)，基因工程可以產(chǎn)生取之不盡、用之不竭的抗蟲蛋白庫?？紤]到新穎害蟲治理技術(shù)的迅速積累，監(jiān)管障礙比技術(shù)障礙更可能限制這些技術(shù)的發(fā)展。

最近開發(fā)的基因編輯工具CRISPR因其高精度可能面對較少的監(jiān)管和應(yīng)用障礙。與以前的方法相比，CRISPR/CAS 9在技術(shù)上的挑戰(zhàn)性較低，增加了更廣泛開發(fā)轉(zhuǎn)基因生物防治劑的前景，這一工具已經(jīng)成功應(yīng)用于球孢白僵菌。

目前有建議使用CRISPR/Case 9改變昆蟲基因組，改變基因調(diào)控，以便于害蟲治理。若與基因驅(qū)動(gene drive)結(jié)合，一種轉(zhuǎn)基因昆蟲有可能取代野生型。鑒于這一可能性，目前的使用僅限于采取嚴格限制措施的實驗室，對有害基因在害蟲種群中不可逆轉(zhuǎn)的擴展的擔憂可能會阻礙基因驅(qū)動生物的田間應(yīng)用。一種低風險的替代方法是采用克隆繁殖的生物防治劑，如綠僵菌，攜帶有利于病原體存活性狀，而非目前提議的有害性狀。目前正在匯集分子生物學知識和技術(shù)，以便能夠創(chuàng)造具有寄主專一性的微生物(如蚊子)，因比化學藥劑在環(huán)境中具有更長持效期，故防治成本更低廉。這類菌株的生產(chǎn)和利用可能面臨巨大的監(jiān)管障礙，但好處也很多。

鑒于轉(zhuǎn)基因植物在世界大部分地區(qū)日益被公眾接受，如果人們對其獨特生物學的了解繼續(xù)增加，并采取適當?shù)拇胧┐_保公眾接受，那么轉(zhuǎn)基因殺蟲微生物的田間應(yīng)用前景光明。預計，在20～30年內(nèi)，生物農(nóng)藥市場可能被真菌(如綠僵菌)所主導，有大量的轉(zhuǎn)基因菌株可用于解決害物治理問題。但更有可能的是，這些菌株不會成為害物治理的靈丹妙藥，而是與其他手段綜合構(gòu)成一個商業(yè)上可行的、可持續(xù)的長期害物治理方案。生物技術(shù)可以為全球面臨的許多作物害蟲、雜草和病害問題提供解決辦法，但與轉(zhuǎn)基因作物不同的是，這些轉(zhuǎn)基因技術(shù)大多尚處于非常初期的開發(fā)階段。監(jiān)管機構(gòu)愿意解決這些技術(shù)在開發(fā)過程中面臨的問題，但這一工作需要明確而有力的推動力，比如防治病媒傳播疾病的可能性。