俞志杰， 寧雪飛， 王賢磊， 李 冠

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046)

甜瓜(CucumismeloL.)是葫蘆科(Cucurbiaceae)甜瓜屬(CucumisL.)1年生蔓性草本植物，基因組大小為 450 Mb[1]。甜瓜在國內(nèi)外廣泛種植，尤其新疆甜瓜在國內(nèi)外享有盛譽(yù)，遠(yuǎn)銷全國各地并出口到東南亞許多國家[2]。但近年來，細(xì)菌性果斑病已成為危害甜瓜產(chǎn)業(yè)的主要病害之一。國外研究報(bào)道，該病最早于1969年在美國福羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)，近年來已迅速蔓延至13個(gè)國家和地區(qū)[3-4]。甜瓜大部分的經(jīng)濟(jì)損失是由細(xì)菌性果斑病引起的病害，病發(fā)嚴(yán)重時(shí)細(xì)菌性果斑病引起的損失超過90%，甚至絕收[5-6]。我國新疆、內(nèi)蒙古、海南等9個(gè)省份的甜瓜作物曾大規(guī)模暴發(fā)細(xì)菌性果斑病[7]。

1978年Schaad等將甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種(Pseudomonaspseudoalcaligenessubsp.citrulli)[8]。1992年Willems等根據(jù)rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交的結(jié)果，將該病原菌更名為燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，簡(jiǎn)稱Aac)[9]。在國內(nèi)，趙延昌等最早對(duì)新疆甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為引起甜瓜細(xì)菌性果斑病發(fā)生的病原菌是燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)，屬革蘭氏陰性菌[10]。田間發(fā)生瓜類細(xì)菌性果斑病主要是由于病原菌通過傷口和氣孔侵染寄主，病害遠(yuǎn)距離傳播是通過種子帶菌進(jìn)行傳播[11-12]。目前，由于細(xì)菌性果斑病導(dǎo)致瓜類商品的經(jīng)濟(jì)效益嚴(yán)重下降，對(duì)瓜類產(chǎn)業(yè)造成威脅，因此，必須采取有效的措施防治該病害的發(fā)生。

目前，田間防治果斑病主要依靠含銅的化學(xué)藥劑[13]，長(zhǎng)期使用化學(xué)試劑，不僅導(dǎo)致病原菌對(duì)化學(xué)試劑產(chǎn)生抗藥性，而且污染環(huán)境、威脅人類的健康。而在選育抗果斑病品種方面，目前主要集中在傳統(tǒng)雜交育種上。傳統(tǒng)的雜交育種不僅耗時(shí)耗力還在表型選擇上存在局限性，致使育種工作進(jìn)展緩慢[14]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，利用分子標(biāo)記輔助育種具有巨大的潛力，也為抗病育種提供了一項(xiàng)方便、快捷、高效的方法[15]。尤其是甜瓜基因組序列已于2012年6月公布[16]，科研工作者利用基因組序列開展甜瓜相關(guān)的分子育種工作變得非常方便。因此，發(fā)掘抗細(xì)菌性果斑病資源，利用分子標(biāo)記手段輔助培育高抗果斑病的新品種是解決問題的有效途徑。雖然國外和國內(nèi)的科學(xué)家在抗果斑病種質(zhì)鑒定方面做出了很多努力，但關(guān)于抗果斑病基因的遺傳機(jī)制研究較少，對(duì)遺傳規(guī)律的發(fā)掘相對(duì)滯后[17]，因此，研究甜瓜果斑病抗性基因的遺傳分析及定位已迫在眉睫。本試驗(yàn)以遼寧神帥抗病品系和皮山奎瑞克感病品系的F2分離群體作為試驗(yàn)材料，采用集群分離分析法(bulked segregation analysis，簡(jiǎn)稱BSA)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR)分子標(biāo)記的方法進(jìn)行果斑病抗性基因的遺傳規(guī)律和定位研究，以期了解抗病品種遼寧神帥所含的抗性基因，為今后的抗果斑病基因精細(xì)定位和抗性種質(zhì)資源應(yīng)用于甜瓜品種的改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于構(gòu)建分離群體的抗病親本材料遼寧神帥和感病親本材料皮山奎瑞克，均由國家瓜類工程研究技術(shù)中心提供。果斑病病原菌采自國家瓜類工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)田(新疆昌吉地區(qū))，在新疆大學(xué)生物工程研究中心凍存。

1.2 主要試驗(yàn)試劑

溴化十六烷三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB)、β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)、Tris-base、RNase A等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；用于PCR相關(guān)反應(yīng)的試劑及Marker，均購自貝思汀生物科技有限公司；SSR引物由華大基因合成。其他分子試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌菌懸液的制備 果斑病病原菌的擴(kuò)繁活化采用LB固體培養(yǎng)基(5 g胰化蛋白胨、2.5 g酵母提取物、2.5 g NaCl、7.5 g瓊脂，用蒸餾水定容至500 mL，pH值為7.4)，在28 ℃溫度下培養(yǎng)36 h，并在無菌條件下挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，用無菌水將菌懸浮液濃度調(diào)至5×108CFU/mL用于接種[18]。

1.3.2 接種及病情鑒定 抗病鑒定試驗(yàn)于2016年6—7月在新疆大學(xué)生物研究中心進(jìn)行，將抗病親本、感病親本各10粒、F2分離群體120粒種子種植于營養(yǎng)缽中。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至2～4張真葉完全展開時(shí)(約生長(zhǎng)25 d)[17]，將待用的菌懸液采用噴霧接種的方法接種，并及時(shí)用塑料膜保溫保濕。10～15 d充分發(fā)病后調(diào)查病情等級(jí)，本研究參照Hopkins等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]，并適當(dāng)修改(表1)。

表1 單株幼苗感果斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 抗感池的構(gòu)建和基因組DNA的提取 用病情級(jí)別為 0～1級(jí)的21個(gè)極抗植株構(gòu)建抗病池，用病情級(jí)別為7～8級(jí)的11個(gè)感病植株構(gòu)建感病池。采用Porebski等的CTAB法[19]提取各單株的DNA，并將提取的DNA溶液稀釋至 100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抗果斑病基因的初步定位 參照文獻(xiàn)[20-21]，均勻選取分布于甜瓜12條連鎖群上的288個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)2個(gè)基因池進(jìn)行檢測(cè)，篩選在抗病池、感病池之間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記。SSR擴(kuò)增體系為20.00 μL，其中DNA模板0.40 μL，10×PCR buffer(含15 mmol/L Mg2+)2.00 μL，上、下游引物(50 μmol/L)各0.20 μL，10 mmol/L dNTPs 0.40 μL，TaqDNA酶(Biomed，China，5 U/μL)0.24 μL，用ddH2O補(bǔ)足20.00 μL。SSR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。SSR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與初步定位的結(jié)果驗(yàn)證 用Excel 97-2003和JoinMap 4.0處理、分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。在抗病池、感病池之間有多態(tài)性的標(biāo)記用F2個(gè)體驗(yàn)證，從而確定初步定位的結(jié)果。與感病親本的帶型相同記為“A”，與抗病親本的帶型相同記為“B”，F(xiàn)1帶型記為“H”，缺失或模糊不清記為“-”。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2群體抗性分析

種植的120粒F2分離群體種子，除去未發(fā)芽和弱小植株外，對(duì)剩余的100株幼苗進(jìn)行病情調(diào)查。由圖1可知，將1～5級(jí)記為抗病，6～8級(jí)記為感病，F(xiàn)2世代的病情分級(jí)呈連續(xù)性分布，說明甜瓜抗果斑病基因?qū)儆跀?shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，簡(jiǎn)稱QTL)。

2.2 抗病池、感病池引物的篩選

用288對(duì)SSR引物分別對(duì)抗病池、感病池進(jìn)行PCR，經(jīng)過多次重復(fù)后，由圖2可知，有7對(duì)引物在抗病池、感病池之間能夠穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出多態(tài)條帶，多態(tài)性比率為2.43%，依次為EMAGN73(95)、ECM122(96)、GCM336(101)、ECM53(102)、ECM231(106)、GCM246(111)、CMAGN61(114)，其多態(tài)性引物序列如表2所示。7對(duì)標(biāo)記都分布于連鎖群(linkage group，簡(jiǎn)稱LG)Ⅳ上，因此將抗果斑病基因初步定位到LGⅣ上。

2.3 初步定位結(jié)果驗(yàn)證

篩選出的7對(duì)引物分別在100個(gè)F2群體的單株中進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)，其中BCM184標(biāo)記與抗性基因連鎖最為緊密。由圖3可知，BCM184標(biāo)記在21個(gè)高感單株中擴(kuò)增，除個(gè)體2無擴(kuò)增條帶外，個(gè)體11、13、18均擴(kuò)增出感親多態(tài)性條帶。在11高感單株中，個(gè)體24沒有擴(kuò)增出條帶，個(gè)體23擴(kuò)增出抗親多態(tài)性條帶。由此說明，BCM184標(biāo)記與甜瓜果斑病抗性基因具有連鎖關(guān)系。用100個(gè)F2分離群體進(jìn)行個(gè)體驗(yàn)證(結(jié)果如圖4)，BCM184標(biāo)記與抗果斑病基因的連鎖距離為12.4 cM。

表2 抗感基因池間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物

3 討論與結(jié)論

關(guān)于果斑病的報(bào)道，國內(nèi)外主要圍繞瓜類細(xì)菌性果斑病病菌的分離檢測(cè)、致病機(jī)制、遺傳多樣性及防治等方面的研究[13]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室多年來一直從事甜瓜抗病研究，積累了較為豐富的經(jīng)驗(yàn)，筆者認(rèn)為果斑病已成為威脅甜瓜產(chǎn)業(yè)的主要病害之一，但其抗性基因的定位之所以鮮有報(bào)道，原因是抗病種質(zhì)資源有待發(fā)掘、抗性基因的遺傳機(jī)制符合QTL遺傳等[22-23]，導(dǎo)致后續(xù)定位難度增加。

國內(nèi)外果斑病接種方法包括浸種法、噴霧法、瓜期接種法、離體法等。浸種法是將種子在菌液中浸泡10～12 h，雖然該方法能夠快速接種，但會(huì)造成幼苗迅速死亡，損失率高達(dá)80%[24]，因此不適合本試驗(yàn)接種。瓜期接種法一般選擇開花授粉15 d后大小一致、健康、坐果節(jié)相同的甜瓜果實(shí)[7]，此方法的缺點(diǎn)是不適合實(shí)驗(yàn)室等小規(guī)模試驗(yàn)，且周期較長(zhǎng)。離體法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、易于人工控制溫度、濕度等外界環(huán)境因素，但此法與瓜期接種法的缺點(diǎn)相同。本試驗(yàn)采用的接種方法是噴霧法，李俊閣用浸種、噴霧、針刺、離體等4種方法對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行抗性種質(zhì)的篩選，其中用噴霧法接種病原菌后對(duì)甜瓜葉片可溶性蛋白、過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病材料和感病材料有明顯的差異[7]。通過苗期噴霧接種鑒定，調(diào)查植株所有葉片病斑面積大小統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，以此確定不同甜瓜材料之間的抗病指數(shù)，可以較準(zhǔn)確地反映不同材料之間存在的差異[17]。

SSR標(biāo)記相比于其他的分子標(biāo)記如擴(kuò)增的限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱ARLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomly amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱RAPD)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱SRAP)等，明顯的優(yōu)勢(shì)在于分布廣、共顯性、操作簡(jiǎn)單、高度可重復(fù)等[25-26]。因此，SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、分子輔助育種、種子純度鑒定、親子鑒定、遺產(chǎn)多樣性等研究中[27-30]。近年來，利用SSR分子標(biāo)記定位的甜瓜基因包括裂葉基因pll、矮化基因mdw1、短側(cè)枝基因slb、抗白粉病基因Pm-2F、Pm-Edisto47-1、Pm-AN等[31]。鑒于SSR分子標(biāo)記的諸多優(yōu)點(diǎn)以及前人采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)在甜瓜多項(xiàng)研究中取得的良好試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)甜瓜抗細(xì)菌性果斑病進(jìn)行定位研究。

本試驗(yàn)中病情調(diào)查結(jié)果顯示，F(xiàn)2抗病植株和感病植株分別有75、25株。因此，將抗病植株細(xì)化分為5個(gè)等級(jí)，而感病品種分為3個(gè)等級(jí)。BCM184標(biāo)記在高感21個(gè)單株中擴(kuò)增，擴(kuò)增出17個(gè)抗親多態(tài)性條帶和F1多態(tài)性條帶，3個(gè)感親多態(tài)性條帶。在高感單株中，擴(kuò)增出2個(gè)抗親多態(tài)性條帶和F1多態(tài)性條帶，8個(gè)感親多態(tài)性條帶。這一結(jié)論與表型性狀相吻合，說明抗果斑病基因受部分顯性基因控制。本試驗(yàn)對(duì)抗性品種遼寧神帥所含的抗性基因的遺傳規(guī)律及所屬連鎖群的研究，為進(jìn)一步開展甜瓜抗細(xì)抗菌性果斑病基因定位克隆和抗性甜瓜的選育奠定了基礎(chǔ)。