卿冬進(jìn) ，劉開強(qiáng)，楊燕宇，高利軍, 黃 娟, 高 菊, 戴高興, 周維永,梁海福, 鄧國富 *

(1. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室，廣西 南寧 530007；2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 廣西 南寧 530007；3. 武漢市景肽生物科技有限公司，湖北 武漢 430075； 4. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所， 廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻是全世界重要的糧食作物之一，養(yǎng)育了全球約50 %的人口[1]。水稻稻瘟病(rice blast)是由子囊菌(Magnaportheoryzae)引起的真菌危害性病，是影響水稻的產(chǎn)量最大的病害之一，嚴(yán)重時使水稻減產(chǎn)40 %～50 %，甚至達(dá)到顆粒無收的程度[2-3]。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上控制稻瘟病害方法主要是化學(xué)防治和種植抗稻瘟病品種防治?；瘜W(xué)防治方法雖然在一定程度上能減少稻瘟病對水稻產(chǎn)量的損失，但是大量使用農(nóng)藥會造成田間環(huán)境污染，甚至增加稻米的農(nóng)藥殘留量，種植抗病水稻品種是防治稻瘟病爆發(fā)的最經(jīng)濟(jì)、安全的方式[4]。目前，普通的分子標(biāo)記方法用于抗性品種育種過程中基本都需要耗時的DNA電泳分析，因此，利用PARMS技術(shù)建立抗稻瘟病基因Pigm的熒光分子標(biāo)記，可為抗稻瘟病水稻品種分子育種提供簡便、可靠的基因分型檢測方法，對培育稻瘟病抗性水稻品種具有實際研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system)技術(shù)，是一種基于擴(kuò)增受阻突變體系PCR(ARMS-PCR，Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction)檢測技術(shù)[5]，其原理是：在ARMS-PCR基礎(chǔ)上增加了兩條帶有不同熒光的檢測引物，可以分別檢測兩條等位基因正向引物5’端的互補(bǔ)序列，經(jīng)過與同一條反向引物PCR擴(kuò)增以后，待測位點的多態(tài)性即可通過不同的熒光信號檢測出來。目前為止，至少報道了69個抗稻瘟病位點，共有84個主效基因[6]，其中Pi1[7]、Pi2[8]、Pi9[9]、Pigm[10]、Pid3[11]、Pizt[8]、Pi56[12]、Pia[13]、Pib[14]、Pita[15]等25個抗稻瘟病基因已被克隆。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)技術(shù)具有高效、安全、可靠的優(yōu)點，在水稻的分子育種上改良個別性狀的應(yīng)用越來越廣泛[16]?？沟疚敛』蛟诜肿訕?biāo)記輔助育種上的應(yīng)用越來越廣泛，如Pib[17]、Pi-d2[18]、Pita[19]等抗性基因分子標(biāo)記已經(jīng)用于分子育種上。Pigm基因來源于水稻品種谷梅4號中的一個持久廣譜抗稻瘟病基因，已被定位到水稻第6染色體短臂上靠近Pi2/9位點[10]，該基因由多個NBS-LRR類抗病基因組成，其中PigmS和PigmR是2個有功能蛋白，它們通過競爭形成異源二聚體，使PigmR的致病性進(jìn)化減慢，從而達(dá)到持久抗病[20]。目前Pigm基因已被越來越多的水稻育種研究者用于分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行抗稻瘟病水稻品種選育。梁毅等[21]根據(jù)Pigm在谷梅4號和9個秈稻親本的多態(tài)性篩選獲得共顯性InDel標(biāo)記DG-3，并利用該標(biāo)記在回交群體中選擇到包含目的基因的單株。楊平等[22]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將谷梅4號的Pigm基因回交導(dǎo)入到感病的春恢350中，獲得了3個帶有目標(biāo)基因的改良純化株系，經(jīng)過菌株接種實驗鑒定，導(dǎo)入系的抗性頻率達(dá)到85 %～100 %。田紅剛等[23]利用雜交、回交、分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將Pigm基因?qū)刖酒贩N空育131、墾鑒稻6和龍粳26中，大幅度提供了對稻瘟病的抗性，抗性頻率達(dá)到95.2 %～98.4 %。張禮霞等[24]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將Pigm基因?qū)胝?4B中，獲得了23份近等基因系材料，對人工接種4個浙江省稻瘟病優(yōu)勢菌株和自然誘發(fā)鑒定均表現(xiàn)為抗穗頸瘟。呂學(xué)蓮等[25]以谷梅4號和粳稻材料MP3為供體，利用花粉管通道技術(shù)將其基因組DNA導(dǎo)入SD-2、SD-3、DJ13等品種，并利用Pigm基因的顯性標(biāo)記進(jìn)行檢測，篩選到的目標(biāo)基因?qū)氲年栃灾仓?07株進(jìn)行進(jìn)一步加代培育與輔助選擇。最近研究報道表明利用分子標(biāo)記輔助選擇方法將Pigm基因用在改良水稻品種稻瘟病抗性方面具有優(yōu)越的應(yīng)用價值?！颈狙芯壳腥朦c】利用PARMS技術(shù)開發(fā)了Pigm基因熒光分子標(biāo)記，經(jīng)PCR擴(kuò)增、熒光掃描后快速獲得基因分型結(jié)果，擺脫了瓊脂糖電泳對PCR產(chǎn)物檢測的繁瑣工作。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用抗稻瘟病基因Pigm序列與其等位基因Pi2、Pi9及感病品種日本晴中的等位基因的序列差異，結(jié)合PARMS技術(shù)建立共顯性熒光分子標(biāo)記PM-Pigm的方法，對48份水稻親本材料的Pigm基因型及其稻瘟病抗性進(jìn)行研究，擬解決運(yùn)用普通分子標(biāo)記過程中費(fèi)時的問題，為利用抗稻瘟病基因Pigm分子標(biāo)記快速進(jìn)行基因分型提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室提供的48個水稻親本材料(表3)。供試稻瘟病菌株來源于廣西壯族自治區(qū)岑溪市稻瘟病區(qū)的2個單胞分離培養(yǎng)菌株。經(jīng)過接種中國鑒別寄主測試，分別為菌株ZB1和ZB13。

1.2 稻瘟病苗瘟抗性評價

48個水稻親本種子經(jīng)浸種2 d，催芽1 d后播種到裝有肥泥的搪瓷盆內(nèi)(52 cm×37 cm)，每個接種的菌株播一盆，每個親本材料播種12粒，加水濕潤管理。待生長到一葉一心時對每盆施尿素2.5 g；待秧苗生長到3葉期，去除弱苗，每盆再施尿素2.5 g；待秧苗生長到4葉期，在接種箱內(nèi)用噴霧接種方法將稻瘟病菌分生孢子接到秧苗上，每盆苗接種一個菌株，菌液量45 ml，待孢子沉降后將秧苗轉(zhuǎn)移到28 ℃的黑暗保濕箱內(nèi)放置24 h，然后將秧苗轉(zhuǎn)移到保濕篷內(nèi)再保濕5 d，接種7 d后進(jìn)行調(diào)查分析，稻瘟病情分析依據(jù)IRBN[26]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗性分級，0～2級為抗(R)，3級為中抗(M)，4～9級為感(S)。

1.3 水稻葉片組織基因組DNA提取

2018年4月23日，采取種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)水稻田的48個水稻親本材料葉片，參考Murray等[27]的CTAB方法提取新鮮水稻葉片組織的基因組DNA。提取到的基因組DNA溶解在TE緩沖液中用于后續(xù)的等位基因檢測實驗。

圖1 Pigm基因中用于標(biāo)記開發(fā)的序列等位分析結(jié)果Fig.1 Allelic analysis result of Pigm gene for maker development

表1 標(biāo)記引物序列

1.4 等位基因型檢測方法

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μl，體系包含：5 μl 2×PARMS master mix(包含2條通用熒光引物)，0.15 μl 10 mMAllele-T標(biāo)記引物，0.15 μl 10 mM Allele-C標(biāo)記引物，0.4 μl 10 mM Common-R通用反向引物，1 μl模板DNA (10～100 ng)，3.3 μl ddH2O。PCR反應(yīng)程序為94 ℃，3 min；然后10個循環(huán)94 ℃，20 sec，65 ℃ (-0.8 ℃每循環(huán))，1 min；然后30個循環(huán)94 ℃，20 s，57 ℃，1 min。將PCR產(chǎn)物在包含F(xiàn)AM、HEX和ROX 3種熒光檢測通道的酶標(biāo)儀中進(jìn)行快速檢測，讀取熒光強(qiáng)度信號值，然后將熒光信號值文件通過SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，結(jié)合標(biāo)記信息，自動進(jìn)行基因分型，獲得基因型結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記引物設(shè)計

利用抗稻瘟病基因Pigm序列與其等位基因Pi2、Pi9及感病品種日本晴中的等位基因的序列差異(圖1)，設(shè)計其共顯性分子標(biāo)記PM-pigm，其引物序列見表1。Pigm序列等位分析結(jié)果顯示谷梅4號中的序列跟Pi2、Pi9及日本晴中的等位基因的序列差異為T/C(圖1)，因此利用差異的SNP設(shè)計為標(biāo)記引物的3’末端。標(biāo)記引物Allele-T能跟PARMS master mix中的HEX熒光引物匹配結(jié)合，而Allele-C能跟PARMS master mix中的FAM熒光引物匹配結(jié)合，從而根據(jù)不同的熒光信號獲得不同的基因型(表2)。根據(jù)序列比較結(jié)果分析，預(yù)測PCR反應(yīng)后，谷梅4號的Pigm基因擴(kuò)增一定可以檢測到HEX熒光信號，其它無稻瘟病抗性的親本材料的等位基因擴(kuò)增可以檢測到FAM熒光信號，從而將Pigm在抗性品種的基因型與感病品種的基因型區(qū)分開。

表2 等位基因與熒光標(biāo)記對應(yīng)表

2.2 分子標(biāo)記PM-Pigm檢測Pigm及等位基因在水稻親本中的分布

利用設(shè)計的熒光分子標(biāo)記PM-Pigm檢測了48個水稻親本材料的基因型，PCR擴(kuò)增后，經(jīng)過熒光掃描儀掃描，分析結(jié)果顯示僅在谷梅4號中檢測到HEX熒光信號，其它47個水稻親本都檢測到FAM熒光信號(圖2)。結(jié)合引物設(shè)計的原理分析，谷梅4號中存在Pigm抗性基因的等位基因型為純合TT，另外47個水稻親本材料中沒有檢測到HEX熒光信號，因此不存在Pigm抗性基因型TT。結(jié)果顯示47個親本中檢測到FAM熒光信號，其存在等位基因型為純合CC。

圖2 PM-Pigm對48份水稻親本的基因分型檢測結(jié)果Fig.2 Genotyping result of 48 rice germplasm by using PM-Pigm

表3 水稻親本材料對稻瘟病的抗性及PM-Pigm分子標(biāo)記檢測結(jié)果

注： “+”代表有Pigm基因HEX熒光信號，“-”代表其等位基因FAM熒光信號。

Notes:‘+’ indicate HEX fluorescence ofPigmgene, ‘-’ indicate FAM fluorescence of its allele.

2.3 水稻親本對稻瘟病的抗性評價分析

48份水稻親本材料經(jīng)過接種菌株ZB1和ZB13后，對水稻秧苗的葉瘟抗性水平進(jìn)行分級評價。分析結(jié)果顯示(表3)，谷梅4號對ZB1和ZB13兩個稻瘟病菌株都表現(xiàn)為抗(R)，與上述用PM-Pigm分子標(biāo)記檢測到谷梅4號有Pigm基因相關(guān)。而佳福B、Lement、大玉23、浙桂87、My46和三黃占2號也對兩個稻瘟病表現(xiàn)為抗(R)，這些品種中可能存在其它的稻瘟病抗性相關(guān)基因。龍豐B、美B、宇19B等其中一個稻瘟病菌株表現(xiàn)為抗(R)或者中抗(M)的也可能存在其它稻瘟病抗性相關(guān)基因。158B、秋B、博B等對ZB1和ZB13均表現(xiàn)為感(S)，表明這些品種里面沒有Pigm抗性基因，也沒有抗這兩個菌株的其它抗性基因存在。

3 討 論

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已廣泛用于作物育種生產(chǎn)上，其優(yōu)點是能夠快速、精準(zhǔn)跟蹤目標(biāo)現(xiàn)狀基因，且不受環(huán)境因子影響[28]。來源于谷梅4號的抗稻瘟病基因Pigm已成功被部分育種研究者用于改良雜交水稻的稻瘟病抗性。梁毅等[21]利用Pigm共顯性InDel標(biāo)記DG-3開展稻瘟病抗性分子育種，獲得了9個秈稻組合的BC3F1群體。王飛等[29]利用Pigm的InDel標(biāo)記S95477和S29742進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，獲得了82個含有Pigm基因的株系。此類普通的Pigm分子標(biāo)記主要依賴于瓊脂糖電泳或PAGE膠電泳分析，而本研究利用PARMS方法建立的Pigm熒光分子標(biāo)記不需要進(jìn)行電泳分析。該標(biāo)記能準(zhǔn)確檢測到水稻品種谷梅4號中的Pigm對應(yīng)的熒光信號，與普通的Pigm分子標(biāo)記相比較，具有簡便、高效的優(yōu)越性，采用熒光掃描方法直接獲取到等位基因的基因型信號，結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件，可以快速完成大規(guī)模材料的基因型分析，同時可以對大批量的SNP標(biāo)記和樣品進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因驗證和檢測，達(dá)到高通量進(jìn)行基因分型的效果。

本研究對48份水稻親本的抗稻瘟病分級評價試驗中，谷梅4號具有對兩個來源于廣西壯族自治區(qū)岑溪市的稻瘟病菌株都表現(xiàn)抗(R)，且分子標(biāo)記檢測到Pigm的抗性熒光信號，基因型與抗性表型一致，而其它一些品種如佳福B、My46、浙桂87等雖然沒有檢測到Pigm的抗性熒光信號，但是對2個菌株都表現(xiàn)抗(R)，可能跟存在其它抗稻瘟病基因Pi2、Pi5或Pita相關(guān)[30]。Lement、大玉23品種也對兩個稻瘟病菌株均表現(xiàn)為抗(R)，可能這些地方抗性品種還存在待挖掘的抗稻瘟病抗性基因。由于自然界稻瘟病菌具有快速、多樣化變異特性，導(dǎo)致水稻在不同環(huán)境下抗性不穩(wěn)定[31]。因此，在同一水稻品種中通過分子標(biāo)記方法聚合多個抗稻瘟病基因，是培養(yǎng)廣譜、持久抗稻瘟病品種的有效途徑[32]。通過PM-Pigm熒光分子標(biāo)記對親本材料的基因分型檢測，并結(jié)合稻瘟病抗性表型試驗，證明了該熒光分子標(biāo)記的可靠性，為利用Pigm基因用于分子育種研究提供了高效的基因分型技術(shù)。

4 結(jié) 論

利用PARMS技術(shù)結(jié)合抗稻瘟病基因Pigm的等位分析，建立了Pigm基因的熒光分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記檢測了48份水稻親本材料Pigm的基因型，結(jié)合稻瘟病抗性表型鑒定試驗，證明了建立的Pigm熒光分子標(biāo)記PM-Pigm能夠快速、可靠對水稻中抗稻瘟病基因Pigm進(jìn)行基因分型檢測。