蔣欣梅孫天宇劉漢兵雷 楊程 瑤于錫宏趙恒田

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；2林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱 150040；3中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150040）

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance.）也稱短毛獨(dú)活、興安獨(dú)活等，為傘形科獨(dú)活屬亞寒帶地區(qū)常見的草本野生蔬菜，在中國(guó)東北、韓國(guó)、朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)廣泛分布（李富恒 等，2017）。因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化能力，同時(shí)對(duì)風(fēng)濕類病狀、“三高”問題具有顯著的食療效果（王金華 等，2017）。豐富的多酚是老山芹發(fā)揮醫(yī)藥和保健作用的重要活性成分之一。植物多酚（包括黃酮）廣泛存在于植物的根、莖、葉等部位中，既可影響食物的風(fēng)味（多酚味酸、澀），同時(shí)也與抗氧化、抗心血管疾病、抗腫瘤等生物活性密切相關(guān)（Toda，2005）。此外，黃酮類物質(zhì)（槲皮素）對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌也具有抑菌或殺菌作用（Vaquero & de Nadra，2008）。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)老山芹的研究多集中在自然生境和栽培條件等方面以及總酚類物質(zhì)含量積累上，關(guān)于老山芹多酚類物質(zhì)與抗氧化能力之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以葉柄及葉脈部位分別為綠色、紅色及混合色的3份老山芹為試驗(yàn)材料，采用比色法分別測(cè)定葉片和葉柄總酚和總黃酮含量，利用OH·、DPPH·、ABTS+等3種常用抗氧化能力評(píng)價(jià)方法，分析醇提物濃度與其抗氧化能力的關(guān)系，旨在為篩選合適的老山芹材料進(jìn)行深入的功能性研究與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多年馴化獲得的性狀穩(wěn)定的葉柄及葉脈部位分別表現(xiàn)為綠色、紅色及混合色的3份材料，分別為綠色老山芹、紅色老山芹、混合色老山芹。

儀器：酶標(biāo)儀Biotek Elx800；分析天平Sartorius CPA225D；酸度計(jì)Sartorius PB-10。

1.2 試驗(yàn)方法

2017年9月16日，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽試驗(yàn)基地，選擇株高25 cm左右、二年生展葉期的老山芹植株，采摘距地面約20 cm處長(zhǎng)勢(shì)良好的葉作為樣品。取樣時(shí)，每份材料隨機(jī)選取20株植株的葉，將葉片和葉柄分開后分別混合，保存在-80 ℃冰箱中備用，每處理3次重復(fù)。總酚、總黃酮含量以及與抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)（OH·清除能力、DPPH·清除能力、ABTS+清除能力）于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生產(chǎn)設(shè)施工程與環(huán)境實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定。

老山芹葉片、葉柄醇提物的制備：分別將老山芹樣品與70%乙醇按1∶10（質(zhì)量比）用粉碎機(jī)粉碎1 min，搖床振蕩（28 ℃，180 r·min-1）提取16 h，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液，10倍梯度稀釋，待測(cè)。

總酚含量測(cè)定采用Folin酚法，總黃酮含量測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法（Jia et al.，1999）；OH·清除能力測(cè)定參照Zhou等（2009）的方法，DPPH·清除能力、ABTS+清除能力測(cè)定參照Yolanda等（2014）的方法；計(jì)算樣品醇提物對(duì)自由基的清除率。

半清除率（抑制率）IC50的計(jì)算：IC50指清除率（抑制率）為50%時(shí)所需樣品液濃度，用來表示抗氧化劑清除自由基能力抑制活性。將樣品溶液配制成不同濃度梯度的溶液，測(cè)定各濃度樣品液清除率（抑制率），繪制清除率（抑制率）-樣品濃度曲線，由曲線讀出或用方程計(jì)算出IC50。濃度越低，表明清除能力（抑制活性）越強(qiáng)。以抗壞血酸為對(duì)照，濃度分別為61.25、50.99、75.39 mg·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，運(yùn)用Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類老山芹的總酚、總黃酮含量

如圖1所示，不同種類、不同部位的老山芹總酚含量和總黃酮含量總體上呈現(xiàn)出顯著性差異。3種老山芹材料葉片中的總黃酮含量和總酚含量均顯著高于葉柄，葉片中總酚含量為124.41～317.61 mg·g-1，總黃酮含量為 184.37～278.82 mg·g-1；葉柄片中總酚含量為30.52～62.79 mg·g-1，總黃酮含量為77.09～112.52 mg·g-1。不同種類老山芹葉片中總酚含量由高到低依次為：紅色老山芹＞混合色老山芹＞綠色老山芹，且差異顯著；總黃酮含量由高到低依次為：混合色老山芹＞綠色老山芹＞紅色老山芹，差異亦達(dá)顯著水平。

圖1 不同種類老山芹葉片和葉柄中的總酚、總黃酮含量

2.2 不同種類老山芹醇提物的抗氧化能力

2.2.1 不同種類老山芹醇提物對(duì)DPPH·自由基的清除能力 從圖2和表1可以看出，3種老山芹葉片、葉柄醇提物均對(duì)DPPH·自由基有一定的清除效果，且在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，即DPPH·自由基清除率隨醇提物濃度的增加而升高。3種老山芹葉片醇提物對(duì)DPPH·自由基的清除能力均高于葉柄醇提物，清除DPPH·自由基的能力由大到小依次為紅色老山芹葉片＞混合色老山芹色葉片＞綠色老山芹葉片＞紅色老山芹葉柄＞混合色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉柄。其中，紅色老山芹葉片醇提物清除DPPH·自由基能力最強(qiáng)，濃度為0～1.00 g·L-1時(shí)對(duì)DPPH·自由基的清除率為0～89.66%，線性回歸方程為y=80.242x+6.821 9，R2=0.994 9，IC50為0.538 g·L-1，和目前普遍接受的抗氧化劑抗壞血酸（IC50=0.05 g·L-1）相比，紅色老山芹葉片具有一定的抗氧化能力；綠色老山芹葉柄醇提物對(duì)DPPH·自由基的清除能力最弱，濃度為0～3.27 g·L-1時(shí)的清除率為0～84.64%，線性回歸方程為y=23.287x+0.868 2，R2=0.986 8，IC50為 2.110 g·L-1。

圖2 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物對(duì)DPPH·自由基的清除效果

表1 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物清除DPPH·自由基的線性回歸方程和半清除率

2.2.2 不同種類老山芹醇提物對(duì)OH·自由基的清除能力 從圖3和表2可以看出，3種老山芹葉片、葉柄醇提物濃度與OH·自由基清除率之間呈線性關(guān)系，R2值均大于0.97。紅色老山芹葉片、混合色老山芹葉片醇提物對(duì)OH·自由基的清除能力明顯高于其他樣品；不同種類、不同部位老山芹醇提物對(duì)OH·自由基清除能力的次序與清除DPPH·自由基略有差異，依次為紅色老山芹葉片＞混合色老山芹葉片＞紅色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉片＞混合色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉柄；除綠色老山芹葉柄醇提物外，其他5份樣品對(duì)OH·自由基的清除能力均高于陽性對(duì)照抗壞血酸。

圖3 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物對(duì)OH·自由基的清除效果

表2 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物清除OH·自由基的線性回歸方程和半清除率

2.2.3 不同種類老山芹醇提物對(duì)ABTS+自由基的清除能力 從圖4和表3可以看出，隨著醇提物濃度的增加，不同種類、不同部位老山芹醇提物對(duì)ABTS+自由基的清除作用均增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)兩者呈線性關(guān)系，R2值均大于0.98。3種老山芹葉片醇提物對(duì)ABTS+自由基的清除能力均高于相應(yīng)種類葉柄醇提物，由高到低依次為紅色老山芹葉片＞混合色老山芹葉片＞紅色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉片＞混合色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉柄。

圖4 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物對(duì)ABTS+自由基的清除效果

表3 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物清除ABTS+自由基的線性回歸方程和半清除率

2.3 不同種類老山芹醇提物的抗氧化能力與總酚含量、總黃酮含量的相關(guān)性分析

從表4可以看出，老山芹葉片總酚含量與清除DPPH·、OH·、ABTS+自由基能力均呈極顯著正相關(guān)；葉柄總酚含量與清除OH·自由基能力呈極顯著正相關(guān)，與清除DPPH·、ABTS+自由基能力呈顯著正相關(guān)；葉片、葉柄總黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性均不顯著。

表4 不同種類老山芹醇提物抗氧化能力與總酚含量、總黃酮含量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同種類、不同部位老山芹的總酚含量、總黃酮含量大體上表現(xiàn)差異顯著。3種老山芹葉片的總酚含量及總黃酮含量均較高，其中紅色老山芹葉片總酚含量最高，達(dá)317.61 mg·g-1，高于高海榮等（2016）報(bào)道的10種茶葉茶多酚含量；混合色老山芹葉片總黃酮含量最高，達(dá)278.82 mg·g-1，與李琨等（2011）的試驗(yàn)結(jié)果相似。張亮亮等（2013）研究表明，桑葉中多酚及黃酮含量與品種、葉位都有一定的相關(guān)性，不同品種桑葉中總酚和黃酮含量差異較大，葉片部位兩種成分含量高于葉脈和葉柄，品種間的差異可能取決于遺傳因素，葉位間的差異可能是由葉片成熟過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化引起。

本試驗(yàn)中，紅色老山芹葉片醇提物的抗氧化活性最強(qiáng)，混合色老山芹葉片次之，綠色老山芹葉柄最弱，但6份樣品在各個(gè)評(píng)價(jià)體系中的抗氧化能力大小排序卻存在差異，這與董麗紅等（2016）的研究結(jié)果一致，不同的抗氧化體系可明顯影響酚類等活性物質(zhì)的抗氧化活性。相同提取液對(duì)不同自由基的清除效果亦有所不同，這一差異可能源于提取物中不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)不同自由基存在一定的選擇性（曹燕 等，2011）。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，老山芹葉片總酚含量與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)，而總黃酮含量與抗氧化能力無顯著相關(guān)性。說明不同種類老山芹葉片中總酚類物質(zhì)含量差異是導(dǎo)致其提取物抗氧化活性不同的主要原因。事實(shí)上，許多多酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化功能早已被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，這些化合物包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、花青素等（Mcdougall et al.，2005）。但老山芹葉片總酚中究竟是哪種化學(xué)成分在發(fā)揮抗氧化活性，尚有待進(jìn)一步研究。