王子實，李苗苗，王永明

(復旦大學 生命科學學院，上海 200438)

基因編輯技術(shù)(genome editing)是在基因組水平上對DNA進行修飾的遺傳操作技術(shù).目前最常用的基因組編輯技術(shù)是CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技術(shù)[1].CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括2個元件，分別是具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白和向?qū)NA(guide RNA, gRNA).gRNA是將crRNA和tracrRNA融合得到的，其中crRNA負責識別靶序列，tracrRNA負責結(jié)合Cas9蛋白[2].當gRNA和Cas9蛋白結(jié)合后，gRNA序列就會將Cas9蛋白引導至和其序列互補的基因組區(qū)域，使得Cas9蛋白和目標基因組序列結(jié)合，并切斷基因組DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)[3].細胞內(nèi)修復DNA雙鏈斷裂的2種主要途徑分別是非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HDR)[4].前者經(jīng)常引起堿基的缺失或者插入(indel)，后者會精確地改造基因組序列[5-6].使用CRISPR/Cas9技術(shù)進行基因敲除主要是通過NHEJ途徑實現(xiàn)的，NHEJ引發(fā)的indel會造成目標基因發(fā)生移碼突變，其概率為2/3.純合敲除細胞系的構(gòu)建要求目標基因的所有拷貝都發(fā)生移碼突變.理論上對于雙倍體細胞基因組，2個等位基因都發(fā)生indel引發(fā)的移碼突變的概率是(2/3)2.而如果目標基因在基因組中存在多個拷貝，則編輯后構(gòu)建純合敲除細胞系的概率就進一步降低為(2/3)n(n是基因拷貝數(shù)).所以拷貝數(shù)越多，敲除難度越大.

傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)使用普通的質(zhì)粒表達Cas9和gRNA，是瞬時表達系統(tǒng).質(zhì)粒隨著細胞的傳代擴增而被稀釋，使得Cas9和gRNA在細胞內(nèi)的表達水平下降，進而降低了基因編輯的效率.為了克服上述缺點，本實驗室使用附著體載體(episomal vector)表達Cas9和gRNA，稱為epiCRISPR系統(tǒng)[7].附著體載體可以在真核細胞中擴增[8]，能夠長期表達外源基因.epiCRISPR除了表達Cas9和gRNA，還表達嘌呤霉素抗性基因，在藥物的篩選下，能夠富集轉(zhuǎn)染成功的細胞，提高獲得純合敲除細胞系的效率.同時附著體載體不整合到基因組中，編輯完成后，撤除篩選藥物，質(zhì)粒會很快丟失，細胞不再表達外源基因.利用epiCRISPR技術(shù)，可以實現(xiàn)平均80%以上的indel效率.

利用CRISPR/Cas9編輯基因時，編輯不一定會造成基因功能喪失.盡管基因編輯可能會導致多種形式的DNA序列改變，包括堿基置換和indel.但堿基置換可能并不會造成氨基酸的改變；即使氨基酸發(fā)生了改變，如果不是重要功能域的氨基酸，也不會使基因功能喪失.indel一般在幾十個堿基以內(nèi)，如果長度是3的倍數(shù)，會造成氨基酸數(shù)量的改變，但不一定會造成移碼突變.敲除基因的有效方法是在基因編碼區(qū)前端進行編輯，當indel長度不是3的倍數(shù)時，會造成移碼突變，蛋白的翻譯提前終止，進而導致功能喪失.如果在基因上設計2個gRNA，它們中間刪除的長度不是3的倍數(shù)，會增加移碼突變的概率[9].設計2個gRNA還有另外一個優(yōu)點，不同gRNA的活性差異很大，2個gRNA中的一個活性高就可以敲除基因，如果2個活性都高，敲除效率會更高.

HDAC全稱是組蛋白去乙?；?histone deacetylase)，其主要功能是對染色質(zhì)中的組蛋白去乙酰化，與DNA復制、修復以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)都有密切的關(guān)聯(lián)[10].HDAC在生物體內(nèi)和很多基因的表觀遺傳狀態(tài)有關(guān)[11]，是阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病[12]以及黑色素瘤[13]，乳腺癌[14]等多種癌癥的潛在治療位點[15].HDAC家族包含11個基因，分別在不同的代謝過程中負責組蛋白的去乙?；且粋€作用廣泛、功能多樣的基因家族.因此，構(gòu)建HDAC純合敲除細胞系對于研究HDAC基因家族的功能是十分必要的.在本研究中，我們通過敲除HDAC家族基因探討附著體載體表達雙gRNA系統(tǒng)的有效性.一方面可以快速構(gòu)建HDAC基因家族純合敲除細胞系，為將來研究HDAC家族基因功能鋪墊良好的基礎.另一方面，本實驗還可以從技術(shù)層面對結(jié)合使用epiCRISPR技術(shù)和雙gRNA技術(shù)的基因敲除效果進行驗證.

1 材料和方法

1.1 材料

本文中使用的細胞系為神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細胞癌細胞系SK-N-BE(2)和HeLa細胞.轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌E.coliDH5α來源于TIANGEN.所有實驗用到的限制性內(nèi)切酶均來源于NEB.PCR引物合成以及DNA測序由Genewiz蘇州分公司完成.Western blot使用抗體來自Abcam，Santa-Cruz以及CST.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細胞癌細胞系SK-N-BE(2)，培養(yǎng)基使用MEM(Gibco)+10% F12(Gibco)+10% FBS(Gibco)，培養(yǎng)條件37℃，5% CO2.HeLa細胞系，培養(yǎng)基使用DMEM(Gibco)+10% FBS(Gibco)，培養(yǎng)條件37℃，5% CO2.2種細胞均使用Thermo Nunclon系列一次性細胞培養(yǎng)皿進行培養(yǎng).

1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)gRNA以及基因編輯檢測PCR引物的設計

質(zhì)粒構(gòu)建過程中使用的所有內(nèi)切酶以及連接酶均來源于NEB.使用http:∥crispr.mit.edu： 8079/?網(wǎng)址提供的gRNA設計工具，在目標基因的外顯子區(qū)域設計臨近的2段gRNA作為實驗使用的gRNA.并且在gRNA目標區(qū)域附近設計PCR引物，用以在PCR后使用T7E1(NEB)酶切檢測編輯效率.表1(見第414頁)展示了實驗中使用的gRNA以及相應的PCR連接引物以及檢測引物.引物名稱中數(shù)字代表gRNA間距.

1.2.3 轉(zhuǎn)染試劑與細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑： 轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine?2000(Invitrogen).

轉(zhuǎn)染流程： 細胞鋪板，當細胞覆蓋培養(yǎng)皿底部60%～70%時進行轉(zhuǎn)染.對于常見的6孔板培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)染而言： 樣品1，使用150mL Opti-MEM(Gibco)與5μL Lipo 2000(Invitrogen)充分混合.樣品2： 150mL Opti-MEM(Gibco)與2000ng待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒充分混合，樣品1，樣品2在各自室溫靜置5min后充分混合到一起，再次室溫靜置20min.之后將混合樣品均勻滴加至細胞培養(yǎng)皿內(nèi)部.輕微搖晃培養(yǎng)皿使轉(zhuǎn)染試劑與培養(yǎng)基混勻.轉(zhuǎn)染17～20h后，更換新鮮的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并使用相應的藥物對細胞進行篩選.

1.2.4 單克隆細胞分選與培養(yǎng)

開始轉(zhuǎn)染為第0天.在使用藥物篩選10天后，使用細胞計數(shù)法對編輯后的細胞進行稀釋分選，確保96孔板(Thermo)平均每孔中有一個細胞.在第15天觀察每孔中實際細胞數(shù)量和細胞存活情況，確認真正的單克隆數(shù)量.第20天后將生長正常的單克隆進行傳代，能夠存活到2次傳代以上的單克隆可以認為是一個穩(wěn)定的單克隆.

表1 HDAC基因家族純合敲除細胞建立過程中使用的gRNA以及PCR引物

1.2.5 單克隆細胞編輯效果測序鑒定

根據(jù)基因組上的序列，在目標基因的編輯位點附近根據(jù)巢式PCR原則設計檢測PCR引物.并使用Genome Quick Extraction(Epicentre)試劑回收第20天單克隆細胞基因組.使用設計好的PCR引物對提取的單克隆基因組進行PCR，得到編輯后的目標基因序列(500～700bp長度)的PCR產(chǎn)物.再通過的pGEM-T Easy T(ProMega)載體連接系統(tǒng)將PCR產(chǎn)物連接到T載體上.使用TIANGEN產(chǎn)E.coliDH5α將連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化擴增，并通過T載體測序結(jié)果確認單克隆的編輯情況.測序結(jié)果使用Vector NTI軟件進行序列比對.

1.2.6 Western blot

使用SDS-PAGE檢測基因敲除前后HDAC基因家族的蛋白表達水平.電泳完成后使用轉(zhuǎn)膜儀(BioRad)進行轉(zhuǎn)膜.之后使用封閉液(1×TBS+0.5% Tween)進行封閉，封閉完成后加入一抗(表2)，再加入二抗進行雜交(表2)，最后使用顯色液(Tanon)進行顯色.

表2 HDAC基因家族蛋白分子量及Western blot中使用的抗體

2 結(jié)果與分析

2.1 含有雙gRNA的epiCRISPR質(zhì)粒的設計與構(gòu)建

本實驗中使用的CRISPR-Cas9質(zhì)粒是自行設計的epiCRISPR質(zhì)粒，其基本結(jié)構(gòu)如圖1所示.其中，hU6啟動子起始gRNA的轉(zhuǎn)錄；EFS啟動子起始Cas9、嘌呤霉素抗性基因(puro)和綠色熒光蛋白基因(GFP)的轉(zhuǎn)錄，這3個基因位于同一個閱讀框內(nèi)，由2A片段隔開.EBNA1是基因組黏附元件，可以將質(zhì)粒黏附于基因組上，使得質(zhì)粒伴隨著基因組的復制而復制，提高質(zhì)粒的表達效率[8].

圖1 含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)Fig.1 The epiCRISPR system contains two gRNAs(a) 含有雙gRNA的CRISPR系統(tǒng)的構(gòu)建；(b) 雙gRNA插入測序確認.

我們發(fā)明了在一個epiCRISPR質(zhì)粒上連接2個gRNA的方法.質(zhì)粒上有2個BspQ1酶切位點，位于hU6和tracrRNA之間.如圖1所示，在這個地方插入crRNA1-tracr-hU6-crRNA2序列，就可以表達2個完整的gRNA.為了實現(xiàn)這個目的，我們設計了一個中間載體，含有tracr-hU6序列.再設計一對與tracr-hU6序列匹配的引物，分別含有crRNA1和crRNA2，同時都含有BspQ1酶切位點.經(jīng)過PCR擴增就得到了crRNA1-tracr-hU6-crRNA2序列，酶切后就可以連接到epiCRISPR質(zhì)粒上了.

為了進一步提高epiCRISPR質(zhì)粒系統(tǒng)的基因敲除效率，我們對原有的epiCRISPR系統(tǒng)進行了改造.目的是在epiCRISPR質(zhì)粒上同時表達2個gRNA，進一步提高系統(tǒng)的基因編輯能力.由于Cas9蛋白本身沒有使CRISPR序列成熟的核酸酶功能，必需借助RNAseⅢ的幫助才能切割串聯(lián)的CRISPR序列(等效于串聯(lián)的gRNA+tracr序列)，使串聯(lián)的CRISPR成熟，形成可以和Cas9蛋白結(jié)合的gRNA序列[3].所以不能簡單地通過前后串聯(lián)2個gRNA來實現(xiàn)不同的gRNA表達.對于外源的CRISPR/Cas9系統(tǒng)而言，為了形成不同的gRNA，必須使用不同的外源啟動子單獨起始表達不同的gRNA.因此我們在原有g(shù)RNA插入位置插入了gRNA1+hU6啟動子+gRNA2的片段，形成了2個hU6啟動子分別負責gRNA1和gRNA2的轉(zhuǎn)錄.這樣我們在一個質(zhì)粒上就實現(xiàn)了2種gRNA的同時表達(圖1).

我們設計的gRNA有如下特點： (1) 2個gRNA之間的堿基數(shù)量不是3的倍數(shù)(表1)，如果中間的部分被切掉后，準確地連接在一起能夠形成移碼突變；(2) 2個gRNA距離很近，都在一個外顯子上，用一對引物就可以檢測編輯的結(jié)果.

為了證明epiCRISPR系統(tǒng)結(jié)合雙gRNA確實能夠增加基因編輯的效率，我們設計了一組對照實驗.分別使用含有EBNA1元件和雙gRNA的質(zhì)粒1以及含有同樣雙gRNA但是不含有EBNA1元件的質(zhì)粒2(圖2(a))同時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，按照1.2節(jié)中步驟分別取轉(zhuǎn)染后第5天和第10天樣品進行編輯效率檢測.檢測結(jié)果如圖2(b)所示.可以看出在第5天的時候，質(zhì)粒1和質(zhì)粒2的編輯效率沒有明顯區(qū)別(lane 2和4).但是經(jīng)過藥物篩選后的第10天，含有EBNA1的質(zhì)粒1由于質(zhì)粒本身能夠隨著細胞基因組復制，因此分裂后的細胞依然繼承了抗性，因此隨著篩選時間的增加，編輯效率也隨之增加(lane 3).而不含有EBNA1元件的質(zhì)粒2轉(zhuǎn)染的細胞由于質(zhì)粒丟失，細胞會逐漸被抗性藥物殺死(圖2(c)).雖然第10天的編輯效率才59%(圖2(b)lane 3)，但是事實上，由于我們的系統(tǒng)使用的是雙gRNA，根據(jù)之前的文獻[9]研究結(jié)果，使用臨近的雙gRNA對目標基因組進行編輯的時候，有較高的概率會恰好將2個gRNA中間的片段完全去除，也就是說使用臨近的雙gRNA編輯的結(jié)果中有很多完全相同的編輯，這些相同的結(jié)果會被T7檢測誤判為未編輯.也就是說第10天的編輯結(jié)果要遠大于59%.

圖2 EBNA1元件增強基因編輯效率Fig.2 EBNA1 enhances gene editing efficiency(a) 質(zhì)粒1和質(zhì)粒2結(jié)構(gòu)示意圖；(b) 基因編輯效率檢測.1. DNA ladder 1000；2. 質(zhì)粒1第5天；3. 質(zhì)粒1第10天；4. 質(zhì)粒2第5天；5. 陰性對照，野生型基因編輯效率檢測；(c) 抗性篩選第10天細胞拍照，不含有EBNA1元件的細胞由于質(zhì)粒丟失已經(jīng)完全被抗性藥物殺死(bar=500μm).

2.2 HDAC1純合敲除細胞系的構(gòu)建

HDAC1作為HDAC基因家族的成員之一，在真核生物基因表達的調(diào)控中起重要作用.HDAC1蛋白是組蛋白乙酰化復合體的成分之一[16].并且，HDAC1能夠增強肺上皮細胞對于A型流感病毒的抵抗[17].HDAC1和肺癌的發(fā)生發(fā)展存在重要的關(guān)聯(lián)[18]，HDAC1的敲除對于食道癌的治療也有積極的意義[19].因此，我們嘗試使用結(jié)合了雙gRNA設計的epiCRISPR系統(tǒng)建立HDAC1純合敲除細胞系.

根據(jù)圖3(a)所示流程，我們將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到了神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細胞癌細胞系SK-N-BE(2)中.轉(zhuǎn)染20h后加入puromycin進行篩選，篩選后第10天進行單克隆分選，之后培養(yǎng)至第20天，選擇能夠穩(wěn)定傳代的細胞系進行測序和Western blot分析.

從實驗結(jié)果(圖3(c)，(d))中可以看出，使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)敲除HDAC1基因，在得到的7個單克隆中，有3個是純合敲除的單克隆(Clone 5，6，7).測序結(jié)果為野生型的Clone1，2，4在對應的Western blot泳道中存在明顯的HDAC1蛋白條帶.測序結(jié)果為純合敲除的Clone 5和6在對應泳道中沒有HDAC1蛋白的條帶.而另一個測序結(jié)果為純合敲除的Clone 7則表現(xiàn)為部分敲除，可能是因為Clone 7的敲除并不完全，HDAC1仍然有部分表達(圖3).純合敲除的細胞生長極其緩慢，說明這個基因?qū)毎L很重要.一部分克隆在培養(yǎng)中死掉，推測也是純合敲除造成的結(jié)果.

圖3 HDAC1純合敲除細胞系的建立Fig.3 The screening of HDAC1 homozygous knockout(a) HDAC基因家族純合敲除細胞系篩選流程示意圖；(b) HDAC1雙gRNA設計以及檢測引物位置；(c) 單克隆測序結(jié)果展示；(d) 單克隆Western blot檢測.紅色框標明純合敲除，藍色框標是雜合敲除.

2.3 HDAC2純合敲除細胞系的構(gòu)建

與HDAC1類似，HDAC2是組蛋白乙酰化復合體的另一個主要成分[16].HDAC2對很多癌癥的耐藥性都具有重要的影響，如對卵巢癌[20]和結(jié)腸癌[21]對化療藥物的敏感性都具有重要作用.

和HDAC1一樣，按照圖3(a)的流程進行單克隆篩選，測序之后進行Western blot驗證(圖4，見第418頁).實驗結(jié)果表明，和HDAC1類似，使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)進行HDAC2純合敲除，篩選的效率也比較高，10個單克隆中得到了2個純合敲除細胞系(Clone 8,10)，這2個細胞系對應的Western blot結(jié)果沒有HDAC2蛋白條帶，說明這2個單克隆做到了HDAC2基因的完全敲除.另外還得到了2個雜合敲除細胞系(Clone 7,9).相對于野生型細胞系，雜合敲除的細胞系中HDAC2蛋白表達量存在明顯的下降(圖4(d)).純合敲除的細胞也是生長極其緩慢.

2.4 HDAC3純合敲除細胞系的構(gòu)建

和HDAC1與HDAC2不同，HDAC3并不是組蛋白乙?；瘡秃象w的主要組成部分，HDAC3主要在各種炎癥因子相關(guān)的生物反應中起作用.HDAC3在風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥反應中調(diào)節(jié)炎癥基因的表達[22].HDAC3在吸煙引發(fā)的胰腺癌中也具有誘導和促進胰腺癌細胞增殖的作用[23].同時HDAC3也是一些發(fā)育過程的必要基因，例如，HDAC3是造血干細胞前體細胞DNA復制的必要調(diào)節(jié)基因[24].

但是按照圖3(a)流程，我們無法得到一個穩(wěn)定傳代的HDAC3純合敲除SK-N-BE(2)細胞系(圖5，見第418頁).存活單克隆的測序結(jié)果全部為野生型.之后，為了驗證這個實驗結(jié)果，我們使用HeLa細胞按照圖3(a)流程進行同樣的HDAC3基因敲除實驗，也無法得一個HDAC3純合敲除HeLa細胞系(數(shù)據(jù)未展示).考慮到HDAC3在生物體內(nèi)以調(diào)控炎癥相關(guān)基因并調(diào)節(jié)一些發(fā)育過程中重要前體細胞的增殖[24]，并且有文獻顯示使用Cre重組酶條件敲除HDAC3會導致細胞分裂S期異常以及DNA損傷修復異常，進而導致細胞死亡[25].而使用類似技術(shù)在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中敲除HDAC3的結(jié)果顯示絕大部分小鼠在出生后24h內(nèi)死亡[26].基于以上結(jié)果，我們認為HDAC3是一個純合敲除致死基因，或者嚴格地說，至少對于SK-N-BE(2)細胞和HeLa細胞而言，HDAC3是一個純合敲除致死基因.

圖4 HDAC2純合敲除細胞系的建立Fig.4 The screening of HDAC2 homozygous knockout(a) HDAC2雙gRNA設計以及檢測引物位置；(b) 單克隆測序結(jié)果展示；(c) 單克隆Western blot檢測.紅色框標明是純合敲除，藍色框標明是雜合敲除.

圖5 HDAC3純合敲除細胞系的建立Fig.5 The screening of HDAC3 homozygous knockout(a) HDAC3雙gRNA設計以及檢測引物位置；(b) 純合敲除單克隆測序結(jié)果舉例.

2.5 HDAC6純合敲除細胞系的構(gòu)建

和HDAC1，HDAC2不同，HDAC6也不是組蛋白乙?；瘡秃象w的組成部分，它主要在細胞防御與病毒介導方面起作用[27].HDAC6的過量表達往往會促進癌細胞的增殖，并增強癌細胞對于化療藥物的抵抗，這種作用在惡性膠質(zhì)瘤[28]和肺腺體癌[29]中都有過相關(guān)報道.

和HDAC1類似，我們同樣按照圖3(a)的流程對HDAC6基因進行純合敲除單克隆篩選，測序之后也進行Western blot驗證(圖6).實驗結(jié)果表明，使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)進行HDAC6純合敲除，在一輪篩選中得到的5個單克隆中，有2個是純合敲除細胞單克隆.這依然是一個非常高的比例.

圖6 HDAC6純合敲除細胞系的建立Fig.6 The screening of HDAC6 homozygous knockout(a) HDAC6雙gRNA設計以及檢測引物位置；(b) 單克隆測序結(jié)果展示；(c) 單克隆Western blot檢測.紅色框標明是純合敲除，藍色框標明的是雜合敲除.

3 討 論

本實驗利用epiCRISPR表達雙gRNA的技術(shù)，在SK-N-BE(2)細胞系中對HDAC基因家族進行敲除，目的是高效的得到HDAC基因家族純合敲除細胞系.有報道表明，如果2個gRNA的位置毗鄰的話，則有較大的概率會使得DNA在斷裂處發(fā)生平末端連接而不是indel[30]，導致2個gRNA之間的片段丟失，造成移碼突變.并且由于2個臨近的gRNA往往設計在同一個外顯子上，即使沒有片段丟失，2個gRNA造成閱讀框發(fā)生錯位突變的概率也遠大于單獨一個gRNA.

HDAC基因家族作為表觀遺傳學中重要的調(diào)節(jié)基因，通過對組蛋白乙?；降恼{(diào)節(jié)影響多種基因的表達，進而參與多種細胞功能，如細胞增殖，細胞凋亡等，這使得HDAC基因家族成為多種疾病的潛在治療靶點.因此，快速有效的建立HDAC基因家族純合敲除細胞系，是進一步研究HDAC基因家族的生物學功能的必要基礎.

最終的實驗結(jié)果中，HDAC1，HDAC2和HDAC6都得到了符合預期的純合敲除細胞系，并且純合敲除的比例高達40%.這個比例和單獨的epiCRISPR實驗[8]以及雙gRNA敲除實驗[9]相比，有了明顯的提高，說明epiCRISPR和雙gRNA敲除這兩種技術(shù)的結(jié)合可以有效地提高獲得純合敲除單克隆的概率.

值得指出的是，我們目前采取的流程是先得到一個穩(wěn)定遺傳的細胞系再進行測序確認.在實際的操作中，我們發(fā)現(xiàn)很多單克隆在生長和傳代的過程中逐漸死亡.這部分死亡的單克隆并沒有在統(tǒng)計結(jié)果中體現(xiàn).推測這一中途死亡的單克隆里面有較大部分是純合子，而雜合子和野生型的單克隆并不容易死亡.這就導致了我們目前的統(tǒng)計結(jié)果中，純合子的比例要低于實際編輯結(jié)果.因此，如果不考慮HDAC3，目前使用帶有雙gRNA的epiCRISPR質(zhì)粒得到的單克隆中，有接近40%的比例是純合敲除.

與家族中其他基因不同，實驗中HDAC3依然沒有得到穩(wěn)定遺傳的細胞系.雖然有部分HDAC3純合敲除細胞系在進行單克隆分選的時候能夠存活，但是無一例外的，這些細胞系都沒有辦法穩(wěn)定傳代，形成可用的單克隆.因此，我們認為，至少對于SK-N-BE(2)細胞系和HeLa細胞系而言，HDAC3是一個純合致死基因.

在本研究中，我對HDAC家族基因進行了敲除實驗，高效快速地得到了HDAC家族基因的純合敲除細胞系.考慮到CRISPR系統(tǒng)本身的廣泛應用性，這種將epiCRISPR系統(tǒng)和雙gRNA技術(shù)結(jié)合起來的方法也能夠適用于其他基因的敲除，可以用于快速構(gòu)建多種基因的純合敲除細胞系，極大地擴展了本實驗技術(shù)的應用范圍.