陳思涵 錢 靖 彭杰軍 魯宇文 鄭紅英 林 林 燕 飛 陳劍平

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，安徽 合肥 230036；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院病毒學與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021；3. 寧波大學植物病毒學研究所，浙江 寧波 315211)

由于植物也是一個生產(chǎn)成本低廉、相對較為安全的高性價比 “綠色工廠”，且植物體內(nèi)可以進行蛋白折疊、復(fù)合體裝配以及糖基化等翻譯后修飾過程，因此植物中表達外源蛋白的研究也成為熱點之一[1]。植物表達系統(tǒng)應(yīng)用于商業(yè)模式存在許多技術(shù)瓶頸，增加植物體內(nèi)重組蛋白產(chǎn)量是難點之一。為提高植物體內(nèi)目的蛋白的表達產(chǎn)量，科研工作者分別從蛋白形成、分泌運輸、降解3個方面展開研究[2]。首先在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平進行研究發(fā)現(xiàn)，使用強啟動子、增加內(nèi)含子、5′-UTR等方式可以有效增加mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，保證外源基因mRNA的表達量及穩(wěn)定性，從而增加重組蛋白表達量[3-4]。同時利用病毒沉默抑制子抑制目的蛋白mRNA降解，也能有效促進重組蛋白表達量的增加[5]。但隨后研究發(fā)現(xiàn)，部分蛋白出現(xiàn)較高的mRNA水平，較低的蛋白產(chǎn)量，研究表明該類重組蛋白可能被植物蛋白降解系統(tǒng)快速降解[6]。這可能與蛋白分泌運輸有關(guān)，植物體內(nèi)部分細胞區(qū)域富含多種蛋白水解酶，目的蛋白一旦處于此類區(qū)域?qū)⒈豢焖俳到?，如合成蛋白從?nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w等細胞器后會導(dǎo)致蛋白降解[7]。在目的蛋白N或C端添加信號肽，通過改變外源蛋白定位可抑制降解速率， ER定位以及葉綠體內(nèi)表達外源蛋白能有效抑制降解[8-9]。根據(jù)蛋白水解酶的降解功能及目的蛋白的表達特性，如在植物細胞BY-2培養(yǎng)液中添加蛋白穩(wěn)定劑，或者共表達蛋白酶抑制子如SlCDI (Cathepsin D inhibitor)[10]、proteinase inhibitor II (I20家族)、Serine proteae inhibitor (I12家族) 等均能一定程度提高外源蛋白的表達量[11-12]。除此之外，通過沉默蛋白水解酶基因的方式也能提高外源蛋白表達，如CysP6沉默可以使外源蛋白表達量增加1.6倍；在BY-2細胞系中NtCP、NMMP1、NtSP等缺失也可以有效提高外源蛋白表達量[13-14]。由此可見，植物外源蛋白表達是一個復(fù)雜的系統(tǒng)過程，抑制蛋白降解過程是有效解決外源蛋白表達量的重要方式。

目前對于植物體內(nèi)外源蛋白的降解研究，主要集中于蛋白水解酶的研究，由于植物體內(nèi)蛋白水解酶具有數(shù)百種，一類蛋白水解酶僅針對某一類外源蛋白，因此很難找到一種適用性較廣的蛋白水解酶抑制策略。細胞自噬途徑是普遍存在于植物體內(nèi)的重要蛋白降解途徑，主要通過細胞內(nèi)雙層膜凹陷形成囊泡結(jié)構(gòu)后，與溶酶體融合成為自噬溶酶體執(zhí)行降解功能。根據(jù)形成自噬體的方式不同可以分為3類：巨自噬、微自噬和伴侶參與的自噬，而在植物中只發(fā)現(xiàn)巨自噬和微自噬[15-16]。自噬途徑涉及30多個蛋白，Atg5是參與自噬途徑的重要基因，在植物體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)一個，它參與Atg8介導(dǎo)的泛素化系統(tǒng)[17]，是自噬途徑的重要蛋白。研究進展可知，自噬途徑對于被UPS (ubiquitin-proteasome system) 標記的異常、變性、未折疊或者縮短的有害蛋白或者細胞器，通過雙層膜包裹降解[18-19]。自噬途徑也可能參與葉綠體、線粒體等內(nèi)含物、細胞器的降解過程，因此自噬途徑是植物體內(nèi)監(jiān)控外源、內(nèi)源蛋白及細胞器的重要功能途徑，但目前未有詳細報道關(guān)于自噬途徑與外源蛋白表達的研究。本研究期望通過添加定位信號、共表達沉默抑制子、沉默atg5，從RNA、蛋白水平來初步探討3類因素對外源蛋白表達的影響，為后續(xù)制定合理的外源蛋白表達策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及農(nóng)桿菌

根癌農(nóng)桿菌EHA105由浙江省農(nóng)業(yè)科學院病毒與生物技術(shù)研究所吳學龍?zhí)峁琾CV1300，p25、HC-Pro、根癌農(nóng)桿菌C58C1由本實驗室提供。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù) (http://nebenfuehrlab.utk.edu/markers/default.htm) 提供的已確認的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、高爾基體等細胞器定位的信號肽序列，以本實驗改造的pCV1300為載體，分別構(gòu)建Gi (Golgi)、ER (Endoplasmie reticulum)、Px (peroxisomes)、Mt (mitochondria)、Pt (plastids)、Ch (chloroplast) 定位載體 (表1)。以本實驗改造的pCV1300為載體，根據(jù)NCBI (KX369397.1) 的Nb-Atg5序列設(shè)計反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，雙酶切構(gòu)建atg5局部沉默載體—siatg5。

表1 定位信號序列Table 1 Sequences of signal location

1.3 本氏煙種植

本實驗所用植物材料均為本氏煙草 (Nicotianabenthamiana)。將本氏煙種子播種于基質(zhì)土 (V(營養(yǎng)土)∶V(蛭石) 為1∶3)，10 d后發(fā)芽分苗，22 ℃，16 h光培養(yǎng)，8 h暗培養(yǎng)，20 d左右成苗，選取6～8葉的本氏煙用于農(nóng)桿菌浸潤實驗。

1.4 農(nóng)桿菌共浸潤實驗

將p25、HC-pro、ER-GFP、siatg5等質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到EHA105農(nóng)桿菌，28 ℃過夜培養(yǎng)。分別挑取單克隆放在5 mL含有5 μL/mL卡那霉素和利福平5 μL/mL的LB 培養(yǎng)基中，28 ℃過夜培養(yǎng) (280 r/min)，次日按照1∶50的比例將1 mL的培養(yǎng)物加到50 mL的含有上述抗生素的培養(yǎng)基中，另加入終濃度為20 μmol/L的乙酰丁香酮 (AS) 和終濃度為10 mmol/L的乙磺酸 (MES)。28 ℃過夜培養(yǎng) (280 r/min) 后，在4 ℃、5 000 r/min的條件下離心20 min收集菌體，該菌體用MMA溶液 (含有終濃度100 μmol/L的AS，終濃度為10 mmol/L MES和終濃度為10 mmol/L的MgSO4) 重懸。按照p25/HC-Pro與ER-GFP終濃度OD600分別為1.000和0.500，siatg5與ER-GFP/Mt-GFP/Pt-GFP/Px-GFP終濃度OD600分別為0.500 0和0.500 0混合，將重懸液在室溫下靜止2～3 h后對本氏煙進行共浸潤，UV下每隔12 h觀察1次。

1.5 GFP蛋白檢測

用直徑2 cm的打孔器取樣，每個樣品取4個亮斑，液氮研磨后加100 μL PBS蛋白提取液，4 ℃裂解12 h后14 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清液獲得植物總蛋白，提取液按比例與5 × loading buffer混合，PAGE膠后轉(zhuǎn)膜，Anti-GFP抗體進行Western雜交。

1.6 GFP mRNA表達水平檢測

用直徑2 cm的打孔器取樣，每個樣品取4個亮斑，液氮研磨后，利用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)后進行半定量檢測。以UBC為內(nèi)參，GFP為檢測引物，每個樣品每對引物分別準備4管，擴增循環(huán)體系為預(yù)變性94 ℃ 5 min，循環(huán)體94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、4 ℃ 1 min，循環(huán)數(shù)28～34個。每個樣品每對引物分別獲得28、30、32、34個循環(huán)時的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖膠后檢測對照和處理樣品的UBC灰度值，分析UBC一致的情況下，對照和處理樣品 GFP條帶的灰度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉默抑制子通過抑制RNA沉默減緩?fù)庠吹鞍捉到?/h3>

mRNA積累量直接決定蛋白的表達水平，RNA沉默是植物體內(nèi)重要的RNA降解途徑，病毒沉默抑制子能有效抑制RNA沉默過程。本研究利用已知的沉默抑制子p25、HC-Pro，以ER-GFP為研究對象 (ER-GFP終濃度OD600=0.500)，確認沉默抑制子對外源蛋白表達的影響。將p25、HC-Pro與ER-GFP共浸潤， UV下觀察GFP熒光的表達。隨著時間推移沉默抑制子一側(cè)熒光明顯強于對照一側(cè)，蛋白檢測顯示p25，HC-Pro能減緩GFP蛋白的降解。以第2天對照樣品GFP蛋白表達量為參照，第6天對照樣品分別下調(diào)至0.35、0.74，第6天沉默抑制子一側(cè)蛋白量(p25/HC-Pro)分別保持在1.56、2.27倍。p25/HC-Pro處理后ER-GFP mRNA在第6天時僅下調(diào)約20%，而對照一側(cè)幾乎降解完全 (圖1a，b)。由此表明，p25/HC-Pro通過抑制mRNA降解來保持較高的GFP蛋白表達量，mRNA的積累能保證較高的外源蛋白表達。

圖1中：a為p25與ER-GFP共浸潤第2～6天，UV、Western blot、半定量檢測結(jié)果；b為HC-Pro與ER-GFP共浸潤第2～6天，UV、Western blot、半定量檢測結(jié)果。Western blot、mRNA檢測條帶數(shù)值通過ImageJ計算出條帶灰度值，將各時間點對照與處理樣品蛋白/mRNA數(shù)值均與第2天對照樣品值比較，第2天對照樣品記為1。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號可顯著提高外源蛋白表達的穩(wěn)定

蛋白合成后運輸?shù)讲煌毎?，將?dǎo)致外源蛋白不同程度發(fā)生降解，為確認各細胞器定位對外源蛋白降解的影響，本研究構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、葉綠體、線粒體等細胞器定位載體，確認各定位信號對蛋白降解的影響。本研究將各細胞器定位載體農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)染本氏煙(OD600=1.000)，注射后2 d各載體出現(xiàn)不同程度的綠色熒光，第6天時除ER外，其余細胞器定位蛋白均已淬滅。各定位載體蛋白檢測結(jié)果也表明， ER蛋白較為穩(wěn)定，其次為GFP、Ch (第6天GFP、Ch-GFP蛋白分別保持在0.40、0.55)。同時各載體mRNA表達量分析表明，ER mRNA降解速度也低于其余樣品 (圖2)。但GI/Px-GFP檢測結(jié)果顯示，第6天時mRNA分別保持在0.43、0.33，其蛋白表達量僅有0.03、0.03，由此可知，高的mRNA表達水平，并非一定具有較高的蛋白表達量，細胞器定位也對蛋白最終表達產(chǎn)生影響。本研究顯示ER定位載體蛋白穩(wěn)定性均高于其他定位載體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號是增加外源蛋白表達的高效定位信號。

圖1 p25、HC-Pro抑制外源蛋白mRNA降解Fig.1 Suppressor p25 and HC-Pro inhibited the degradation of exogenous mRNA

圖2 不同定位信號GFP表達穩(wěn)定性有明顯差異Fig.2 The significant differences in the expression stability of GFP with different localization signals

圖2中：Western blot、半定量檢測條帶數(shù)值通過ImageJ檢測灰度值，將各樣品第4，6天蛋白/mRNA數(shù)值與第2天數(shù)值比較，第2天樣品記為1；各載體浸潤第2～6天，UV、Western blot、半定量檢測結(jié)果，其中Western檢測上樣量除GI為20 μL外，其余樣品均為10 μL。

2.3 atg5沉默能緩解外源蛋白的降解

atg5沉默抑制外源蛋白降解見圖3。

圖3 atg5沉默抑制外源蛋白降解Fig.3 atg5 silencing inhibited the degradation of exogenous proteins

植物體內(nèi)除監(jiān)控外源RNA的途徑以外，存在眾多蛋白監(jiān)控途徑，自噬途徑是植物體內(nèi)重要的蛋白降解途徑，Atg5是自噬途徑中決定自噬囊泡形成的關(guān)鍵基因，且植物體內(nèi)該家族僅有1個基因，對atg5的沉默會直接導(dǎo)致自噬途徑受阻。將構(gòu)建的siatg5與ER-GFP共浸潤 (OD600為0.500)，以sigus+ER-GFP為對照組檢測第2～4天的表達情況，結(jié)果表明atg5沉默一側(cè)GFP蛋白表達量明顯高于對照一側(cè)，第4天對照組蛋白降至0.87，atg5沉默的樣品仍能保持1.12倍表達 (圖3a)。為進一步確認atg5沉默對其他易降解蛋白的影響，本研究分別以穩(wěn)定性稍差的Mt/Pt/Px-GFP為研究對象。結(jié)果表明，atg5沉默部分緩解Mt/Pt/Px-GFP蛋白的降解，第3天時atg5沉默樣品Mt/Pt/Px-GFP分別為第2天對照組蛋白量的1.56、2.97、1.56倍 (圖3b,c,d)。mRNA分析表明，atg5沉默沒有對mRNA的降解速率產(chǎn)生明顯影響。由此可知，atg5沉默能一定程度緩解外源蛋白降解速率。

圖3中：a為atg5沉默后ER-GFP第2～4天，UV、Western blot、mRNA的表達變化；b為atg5沉默后Mt-GFP第2～4天，UV、Western blot、mRNA的表達變化；c為atg5沉默后Pt-GFP第2～4天，UV、Western blot、mRNA的表達變化；d為atg5沉默后Px-GFP第2～4天，UV、Western blot、mRNA的表達變化。Western blot、半定量檢測條帶數(shù)值通過ImageJ檢測灰度值，將sigus與siatg5的樣品蛋白/mRNA數(shù)值分別與第2天sigus樣品蛋白/mRNA灰度值比較，第2天sigus樣品記為。

3 結(jié)論與討論

植物的生產(chǎn)成本低廉，具有蛋白折疊、翻譯后修飾、可以體內(nèi)形成蛋白復(fù)合體等優(yōu)勢，使植物作為生物反應(yīng)器表達外源蛋白，成為近幾十年的研究熱點。目前植物表達系統(tǒng)常用于重要經(jīng)濟價值的藥用蛋白或疫苗的制備等，并在普通煙、本氏煙、水稻細胞等細胞或植株中，成功表達鼠IgG1抗體、hGM-CSF、人類VEGF等[11,20]，均產(chǎn)生較高的經(jīng)濟價值，但植物表達系統(tǒng)仍然存在目標蛋白表達量較低的問題。研究表明篩選合適的啟動子、添加5′-UTR、增加內(nèi)含子、添加3′-UTR的順式作用元件等方法能增加mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，提高mRNA轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性，從而促進外源蛋白表達[3-4]。沉默抑制子抑制RNA沉默途徑也是提高mRNA表達水平的有效手段，本研究也證明p25/HC-Pro與ER-GFP共表達，可以高效抑制mRNA降解，從而使目的蛋白增加1.5～2倍。本研究結(jié)果表明，GI/Px-GFP高的mRNA水平不一定具有較高的蛋白表達，這可能與GI、Px定位有關(guān)[21]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位能有效降低蛋白降解，第6天時仍有1.33倍的蛋白表達。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個多功能管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是蛋白合成、折疊、分泌、跨膜運輸、脂類、甾醇類生物合成的重要場所。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上還能通過分子伴侶和蛋白修飾酶，來確保合成蛋白的正確折疊、修飾并裝配到多蛋白復(fù)合體中，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白合成的重要場所，也是目的蛋白定位的理想工廠。

目前研究顯示外源蛋白降解的原因較為復(fù)雜，可能與細胞內(nèi)分泌蛋白水解酶、目的蛋白被細胞吸收、蛋白自身穩(wěn)定性等有關(guān)。植物中存在大量蛋白水解酶，如擬南芥中大約有1 900個直接或間接參與多肽鏈水解的基因。針對目的蛋白特性抑制蛋白水解酶也是常用的有效手段，如篩選的CDI (Cathepsin D inhibitor)、Oryzacystatin I、能較好的增加蛋白表達，但對蛋白性質(zhì)和表達細胞器位置有一定偏好性。為增加表達蛋白穩(wěn)定性，開發(fā)出種子、胚乳、葉綠體等組織和器官中特異表達外源蛋白的策略[22]。

雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或葉綠體定位可以大量表達蛋白，但過量表達蛋白會造成細胞器受到脅迫，過量蛋白的表達會導(dǎo)致未折疊蛋白過量積累，并被蛋白降解系統(tǒng)識別[23]。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白的過程能被ERAD (ER-associated degradation) 機制監(jiān)控，該系統(tǒng)能將錯誤和未折疊蛋白通過26S泛素化蛋白酶體降解。研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白大量表達會造成UPR (Unfold protein response)，UPR隨后能觸發(fā)自噬途徑，植物細胞利用自噬途徑降解未折疊蛋白[24-25]。葉綠體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的重要細胞器，研究表明葉綠體及內(nèi)含物也與自噬途徑有密切相關(guān)，受到脅迫的葉綠體能被自噬途徑所吞噬[26]，由此可知，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體雖然是理想的外源蛋白表達場所，但由于自身容量限制及細胞的調(diào)控機制，過量表達外源蛋白也能被植物內(nèi)源監(jiān)控系統(tǒng)——自噬途徑所識別調(diào)控。自噬途徑是普遍存在于真核生物中調(diào)控細胞正常生理活動的重要途徑，由于該途徑涉及眾多生物活動，并且與人類癌癥、腫瘤等密切相關(guān)，自噬途徑也成為近期研究的熱點，但目前外源蛋白表達與植物自噬途徑的關(guān)聯(lián)研究尚未明確。

自噬途徑是植物體內(nèi)重要監(jiān)控機制，除參與ER脅迫、葉綠體降解等過程外，自噬系統(tǒng)可能在翻譯后修飾過程如泛素化、乙?；?、磷酸化作用都起到調(diào)節(jié)作用[27]。因此自噬途徑在外源蛋白表達過程中，可能參與蛋白分泌、降解以及翻譯后修飾等過程，基于自噬途徑的重要性，本研究針對自噬途徑重要基因Atg5與外源蛋白降解過程進行初步研究。結(jié)果表明，沉默atg5會導(dǎo)致ER/Mt/Pt/Px等多種細胞器定位蛋白表達量不同程度的增加，自噬途徑可能對多種細胞器定位蛋白起到監(jiān)控作用。Toyooka等研究發(fā)現(xiàn)Cytb5 (cytochrome b5) 融合RFP在BY-2中過表達，能定位于空泡內(nèi)，當自噬途徑被抑制該定位消失，表明外源蛋白可能受自噬途徑調(diào)控，本研究atg5沉默實驗也進一步驗證此推測[28]。由此可知，自噬途徑可能指導(dǎo)外源蛋白的降解過程，但自噬途徑對外源蛋白的具體調(diào)控機制，還有待于做進一步研究。

植物作為生物反應(yīng)器由于成本低，操作簡單一直被廣泛應(yīng)用，但由于外源蛋白表達不穩(wěn)定和表達量低等問題，成為限制植物蛋白表達系統(tǒng)規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸。本研究通過共表達沉默抑制子、添加定位信號、沉默atg5，進一步明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位可以提高外源蛋白的穩(wěn)定性；沉默抑制子可以延緩mRNA的降解提高蛋白表達量；而atg5沉默能有效抑制外源蛋白降解。因此根據(jù)外源蛋白表達要求改變細胞器定位，同時結(jié)合沉默抑制子以及抑制自噬途徑等方式相結(jié)合，可能有效保證外源蛋白的穩(wěn)定高效表達。