孫玉潔， 李春松， 蘆 芳， 吳曉琴， 沈建福*

（1.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058；2.金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 食品藥品檢驗(yàn)評(píng)審科，浙江 金華 321015；3.浙江蕓麒龍翔生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州310000）

目前市場(chǎng)有多種皮膚美白劑，如純化學(xué)物氫醌，天然植物提取物熊果苷、甘草提取物等。純化學(xué)物的美白效果較好，但往往會(huì)帶來(lái)一些副作用，而天然植物提取物由于安全性高，越來(lái)越得到研發(fā)者和消費(fèi)者的青睞。皮膚的美白主要有2種方式，一是抑制黑色素合成酶的活性，如抑制酪氨酸酶，多巴色素互變酶等，以減少黑色素的生成；二是促進(jìn)黑色素排出，如促進(jìn)黑色素的吸收代謝等[1]。天然植物提取物的美白作用通常是通過(guò)抑制酪氨酸酶活性或阻斷酪氨酸生成黑素的氧化反應(yīng)，從而減少黑素的合成而達(dá)到美白皮膚的效果。

香水蓮花 （Nymphaea hybrid）是睡蓮科睡蓮屬熱帶大型睡蓮，既是一種大型觀賞性花卉，又可安全食用，源于香水蓮花的各種產(chǎn)品也被不斷開(kāi)發(fā)利用。作者通過(guò)測(cè)定比較提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響，篩選獲得效果較好的提取物，再應(yīng)用B16黑素瘤細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究香水蓮花提取物對(duì)細(xì)胞黑素合成的影響及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的作用，初步探討其美白作用，以期為純天然美白化妝品的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

黃色、藍(lán)色香水蓮花：由浙江一心園農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，2014年9月采摘，剝?nèi)ポ嗥?，從貼近花托基部切除花梗。其中一部分4℃冷藏，另一部分烘干，裝袋備用；香水蓮花子房提取物：由浙江一心園農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；酪氨酸酶、L-酪氨酸、熊果苷、二甲基亞砜（DMSO）：上海阿拉丁試劑有限公司；B16小鼠黑素瘤細(xì)胞株：上海市中科院細(xì)胞庫(kù)產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)液：美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；HyClone胎牛血清：賽默飛世爾生物化學(xué)制品 （北京）有限公司產(chǎn)品；青-鏈霉素溶液、磷酸緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶：杭州科易生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán) （MTT）、曲通 （Triton-X100）：北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；左旋多巴（L-DOPA）：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；CP-ST50A型二氧化碳培養(yǎng)箱：長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-ZF潔凈工作臺(tái)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；CKX41倒置顯微鏡：日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；MDF-U53V醫(yī)用低溫箱：日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；Eon酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS立式髙壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó)康寧公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 香水蓮花樣品的制備

分別取曬干后的黃色、藍(lán)色香水蓮花整花，去除蟲(chóng)害、霉變部分后粉碎，過(guò)50目篩。按照1 g∶10 mL料液質(zhì)量體積比，分別用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液（V/V）在 50℃溫度下超聲浸提30 min，所得溶液4 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)濾，再經(jīng)減壓旋蒸除去乙醇，凍干48 h，得到香蓮整花提取物粉末。測(cè)定時(shí)將其與子房提取物經(jīng)過(guò)超聲重溶配制成所需濃度的溶液待用。

2.2 香水蓮花提取物的活性成分測(cè)定

2.2.1 總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：采用Folin-Ciocalteu法[2]。精密吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 （0.1 mg/mL） 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL具塞試管中，加入1.0 mL Folin-Ciocalteu試劑和2mL15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10mL，充分混勻后于75℃水浴30 min，以試劑空白為參照，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y，A760），沒(méi)食子酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)（x，mg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=14.7x-0.000 5（R2=0.999 8）。

香水蓮花提取物總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：將各提取物配成1.0 mg/mL的待測(cè)液，取0.2 mL待測(cè)液，按上述步驟測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物干基總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.2 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：參考任紅榮等[3]的方法。精密稱取105℃常壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.100 2 g，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容至50 mL作為母液。正確吸取蘆丁母液1.5、2.5、4.0、5.0、8.0、10.0 mL 置于 25 mL 容量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容。吸取2 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯化鋁，振蕩搖勻后室溫放置15 min，以溶劑加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯化鋁溶液作為空白對(duì)照在425 nm處測(cè)定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)（y，A425nm），蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)（x，μg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.011 2x+0.009 9（R2=0.999 5）。

將各提取物配成1.0 mg/mL的母液，再將整花提取物母液用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇稀釋一倍作為待測(cè)液，子房提取物母液作為待測(cè)液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物干基黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 香水蓮花提取物的美白功效測(cè)定

2.3.1 抑制酪氨酸酶活性測(cè)定 采用體外法測(cè)定，參考任紅榮等[4]的方法。

總反應(yīng)體系為5 mL，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。其中，用分光光度計(jì)測(cè)量吸光值時(shí)，受試組、空白組、熊果苷對(duì)照組分別以陰性對(duì)照組1#、2#和3#管調(diào)零。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，向試管中依次加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度梯度的樣品液和酶液，37℃水浴10 min后加入底物L(fēng)-酪氨酸，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)20 min時(shí)測(cè)定475 nm波長(zhǎng)下的吸光值。測(cè)定時(shí)以相應(yīng)的陰性對(duì)照為參比，用下列公式計(jì)算樣品液和陽(yáng)性對(duì)照對(duì)酪氨酸酶的抑制率，依據(jù)濃度-酶抑制率曲線計(jì)算半抑制濃度（IC50），IC50值低則表明其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果好。

表1 測(cè)定酪氨酸酶活性的5 mL試驗(yàn)體系設(shè)計(jì)Table 1 Design of the 5 mL test system of tyrosinase activity determination mL

2.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 B16小鼠黑素瘤細(xì)胞株購(gòu)于上海市中科院細(xì)胞庫(kù)。每次實(shí)驗(yàn)取自同一傳代細(xì)胞，DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%。

參考Chang[5]等的方法，取指數(shù)生長(zhǎng)期的B16黑色素瘤細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化分散，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板，再補(bǔ)充RPMI 1640新鮮培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞完全貼壁后更換新培養(yǎng)基，每孔加入200 μL不同濃度的受試物溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)液代替美白劑溶液，每天換液，培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞大小、形態(tài)、生長(zhǎng)密度、樹(shù)突形態(tài)以及融合狀態(tài)等，并拍照記錄。

2.3.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 參考Mei[6]等和陳貞純等[7]的方法。細(xì)胞懸浮液前處理同上，細(xì)胞接種12 h后用添加受試美白劑的新鮮培養(yǎng)液換液（各設(shè)4個(gè)劑量組，香水蓮花乙醇體積分?jǐn)?shù)60%提取物和熊果苷的質(zhì)量濃度梯度為 12.5、25、50、100 μg/mL），每孔加入 200 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)液代替美白劑溶液，培養(yǎng)48 h。在測(cè)定時(shí)間前4 h取出，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后棄去培養(yǎng)基和MTT，向各孔中加入150 μL的DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶，震蕩混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm下的吸光值。細(xì)胞增殖率按以下公式計(jì)算：細(xì)胞增殖率（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對(duì)照孔-A空白孔）×100%。

2.3.4 黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以 5×104個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。貼壁后每孔分別加不同質(zhì)量濃度含受試美白劑的培養(yǎng)基 （質(zhì)量濃度梯度為12.5、25、50、100 μg/mL），以不含受試美白劑的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。將細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，傾去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化，再用PBS緩沖液吹打沉淀細(xì)胞，備用。參照Ando等[8]報(bào)道的方法測(cè)定黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取備用細(xì)胞懸液加PBS緩沖液，各吸取1 mL細(xì)胞懸液分別置于離心管中，低速離心10 min后棄去上清液，先加入200 μL蒸餾水使細(xì)胞重新懸浮，然后加入 1 mLV（乙醇）∶V（乙醚液）=1∶1，在室溫下放置 15 min，3000 r/min 離心 5 min 并棄去上清液，加入1 mL含體積分?jǐn)?shù)10%二甲基亞砜的1 mol/L NaOH溶液，然后置于80℃水浴30 min，最后轉(zhuǎn)移到96孔板中，用分光光度計(jì)在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)=（A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）/細(xì)胞增殖率 ×100%。

2.3.5 酪氨酸酶活性抑制率測(cè)定 參考張春香[9]等和Qiu等[10]的方法。細(xì)胞前處理同上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)/ml，96 孔板每孔加細(xì)胞懸液 100 μL， 再補(bǔ)充培養(yǎng)液 100 μL，鋪板 12 h后，棄上清，加入200 μL含不同質(zhì)量濃度美白劑的培養(yǎng)液（質(zhì)量濃度梯度為 12.5、25、50、100 μg/mL），在 37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕性條件下培養(yǎng)，每一質(zhì)量濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以不添加美白劑培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照，培養(yǎng)48 h，每天換液。

采用多巴氧化法對(duì)酪氨酸酶活性進(jìn)行測(cè)定。將孔板中上清液棄去，用PBS緩沖液漂洗后每孔加入1%Triton-X100 40 μL， 迅速放入-80℃冰箱內(nèi)，30 min后取出于37℃融化，破裂細(xì)胞，加入1%LDOPA溶液10 μL/孔，以L-DOPA為本底進(jìn)行校正，以不加美白劑培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，37℃反應(yīng)30 min，置酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處A450值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2013和SPSS 21軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用鄧肯多重比較法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

香水蓮花提取物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖1所示，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取的黃色與藍(lán)色整花提取物中，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨勢(shì)一致。且藍(lán)色整花醇提物的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)普遍高于相同濃度黃色整花醇提物，由圖可知藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物中酚類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，占提取物干基質(zhì)量的 （31.62±0.14）%，顯著高于黃色整花的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30.29±0.19）%（P＜0.01），子房提取物總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為（5.19%±0.18）%。

3.2 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

如圖2所示，香水蓮花提取物中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而增加，且黃色整花提取物所含黃酮高于藍(lán)色整花，用60%乙醇提取時(shí)，這兩種整花提取物所含黃酮分別占干基質(zhì)量的（5.37±0.05）%和（3.72±0.06）%，而在 100%乙醇提取時(shí)分別上升至 （10.42±0.05）%、（6.35%±0.03）%，增加了將近一倍。子房提取物的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為（1.90±0.04）%。由此可見(jiàn)，香水蓮花中低極性的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比高極性的多。

圖1 香水蓮花提取物總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Polyphenols content of Nymphaea odorata Aiton extracts

圖2 香水蓮花提取物黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Flavones content of Nymphaea odorata Aiton extracts

3.3 抑制酪氨酸酶活性測(cè)定結(jié)果

酪氨酸酶是酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏氐闹饕拗泼?，可催化含酚基化合物（如酪氨酸、酚?lèi)化合物等）氧化成多巴醌，經(jīng)一系列中間反應(yīng)后形成黑色素[11]，反應(yīng)過(guò)強(qiáng)可引起黑素過(guò)多癥，如雀斑、黃褐斑等[12]。如圖3所示，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑提取的黃色整花提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果與藍(lán)色整花提取物一致，子房提取物較低，熊果苷較高。該結(jié)果與提取物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨勢(shì)一致，推測(cè)提取物中含有能抑制酪氨酸酶活性的酚類(lèi)物質(zhì)。

由表2可知，相同質(zhì)量濃度下，藍(lán)色整花提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的IC50值普遍低于黃色整花提取物，因此藍(lán)色整花提取物的抑制酪氨酸酶活性效果好。用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇提取的黃色、藍(lán)色整花提取物均具有良好的抑制酶活性效果，其中體積分?jǐn)?shù)60%藍(lán)色整花醇提物在所有香水蓮花樣品中抑制酪氨酸酶活性效果最好，IC50值僅為（0.59±0.01）mg/mL，抑制效果與熊果苷無(wú)顯著差異。

圖3 香水蓮花提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition oftyrosinaseactivity by Nymphaea odorata Aiton extracts

表2 香水蓮花提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率IC50值Table 2 Inhibition rate of IC50values （mg/mL） on tyrosinase activity by Nymphaea odorata Aiton extracts mg/mL

3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

傳代的B16小鼠黑素瘤細(xì)胞主要為兩極貼壁生長(zhǎng)的上皮型細(xì)胞，偶見(jiàn)三極生長(zhǎng)。添加香水蓮花提取物后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示：整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物可干擾細(xì)胞增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，而熊果苷和子房提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

從圖4可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，添加100 μg/mL質(zhì)量濃度的熊果苷和子房提取物的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與對(duì)照組相近，而在香水蓮花提取物作用下，細(xì)胞分布稀疏，尤其是添加了藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞樹(shù)狀突起減少、縮短，許多細(xì)胞呈圓形或不規(guī)形狀孤立存在，細(xì)胞之間很難相互融合形成網(wǎng)狀互聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞旁分泌和細(xì)胞間隙通訊減弱，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞正常生理功能。

圖4 100 μg/mL香水蓮花提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of Nymphaea odorata Aiton extracts（100 μg/mL）on cell growth

3.5 細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果

由圖5所示，香水蓮花60%醇提物在低質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，黃色和藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物對(duì)B16小鼠黑素瘤細(xì)胞增殖開(kāi)始有顯著抑制作用，增殖率分別為（90.17±3.23）%和（83.59±2.04）%；在100 μg/mL濃度下，添加黃色、藍(lán)色整花60%醇提物的細(xì)胞增殖率分別下降到 （84.44±1.77）%、（48.24±3.14）%，顯著低于熊果苷，可見(jiàn)醇提物中活性成分能夠減緩瘤細(xì)胞增殖。許多文獻(xiàn)報(bào)道，天然植物提取物如蘆薈苦素[13]和甘草提取物[14]能夠有效抑制黑素瘤細(xì)胞增殖，起到美白作用。添加了熊果苷培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率為（98.89%±2.55）%，說(shuō)明熊果苷對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。子房提取物具有少許促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可能是因?yàn)樽臃刻崛∥镏泻刑穷?lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分，被細(xì)胞吸收利用從而促進(jìn)增殖。

圖5 香水蓮花提取物對(duì)細(xì)胞增殖率的影響Fig.5 Effect on cell proliferation rate by Nymphaea odorata Aiton extracts

3.6 黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

黑素存在于表皮的基底層，它是決定皮膚顏色的主要因素。皮膚中黑色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)越少，則膚色越淺。由圖6可知，香水蓮花提取物均有抑制細(xì)胞合成黑色素的作用，以空白對(duì)照的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，則添加提取物后黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。在100 μg/mL時(shí)，添加黃色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物培養(yǎng)的細(xì)胞中黑素相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少了30.31%，藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物減少33.02%，抑制黑素合成效果均良好，但由于其為混合初提物，而熊果苷為純物質(zhì)，其抑制效果沒(méi)有熊果苷好。子房提取物對(duì)黑素生成的抑制也有一定效果，100 μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)使單個(gè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少20.90%，但不如整花提取物。

圖6 香水蓮花提取物對(duì)相對(duì)黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect on relative content of melanin by Nymphaea odorata Aiton extracts

3.7 酪氨酸酶活性抑制率測(cè)定結(jié)果

黑色素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶主要有3種：酪氨酸酶、多巴色素互變酶和5，6-二羥吲哚-2-羧酸氧化酶，一般可通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性從而減少黑色素的合成量。如圖7所示，隨著濃度升高，提取物和陽(yáng)性對(duì)照熊果苷對(duì)酪氨酸酶活抑制率均逐步上升，在100 μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)，藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物與熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的相對(duì)抑制率相當(dāng)，達(dá)到（59.47±3.40）%，顯著高于黃色整花 60%醇提物，子房提取物對(duì)酶活的抑制效果并不明顯。該結(jié)果與B16小鼠黑素瘤細(xì)胞內(nèi)黑素相對(duì)含量的結(jié)果相一致，也與體外酪氨酸酶活性抑制率具有一致性，因此，實(shí)驗(yàn)表明香水蓮花提取物有較好的降低細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的作用，從而有效減少細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成量。

圖7 香水蓮花提取物對(duì)酪氨酸酶活性相對(duì)抑制率的影響Fig.7 Effect on relative inhibition rate of tyrosinase activity by Nymphaea odorata Aiton extracts

4 結(jié) 語(yǔ)

豐富多彩的物種資源為美白研究提供了大量的試驗(yàn)材料，從天然產(chǎn)物中提取活性成分成為篩選研究的熱點(diǎn)[15]。作者通過(guò)體外法測(cè)定酪氨酸酶活性和細(xì)胞模型法測(cè)定黑素含量等指標(biāo)研究了香水蓮花提取物的美白效果。

酪氨酸酶是一種含銅的金屬氧化還原酶，廣泛分布于動(dòng)植物、微生物及人體中，具有單酚酶和二酚酶活性[16]，酪氨酸酶位于黑色素體膜上，其活性中心的雙核銅離子在酶催化中起重要作用，是黑色素生成的關(guān)鍵酶[17]，其活性越強(qiáng)，則黑色素合成數(shù)量越多，膚色越深。

體外以酪氨酸為底物測(cè)定酪氨酸單酚酶活性的結(jié)果表明，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取的黃色和藍(lán)色整花提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果強(qiáng)弱具有一致性，均為體積分?jǐn)?shù)60%醇提物效果最好，表明整花提取物具有較好的抑制酪氨酸酶單酚酶活性的作用。同濃度時(shí)藍(lán)色整花提取物抑制效果較黃色整花提取物和子房提取物好，可能是由于藍(lán)色整花提取物中酚類(lèi)含量較高。藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率與熊果苷相當(dāng)，表明其具有很好的美白功效。有許多研究表明，多種花類(lèi)提取物均具有很好的酪氨酸酶活性作用，如蘭花提取物[18]、薰衣草精油[19]、檳榔花沸水提取物[20]、仙蜜果花醇提物[21]等，可作為有效的酪氨酸酶抑制劑。

利用離體細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)篩選美白劑的細(xì)胞生物學(xué)方法，較人體實(shí)驗(yàn)更快速、簡(jiǎn)便，已成為美白功效評(píng)價(jià)的重要手段。天然植物成分往往具有抗氧化能力，能把黑素合成的中間體還原為無(wú)色的多巴色素，淡化皮膚顏色；有些還能使黑素細(xì)胞增殖減緩，從而抑制黑色素的產(chǎn)生[22]；有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)能加快基底層細(xì)胞分裂，逐漸向上推移到表皮層，最后角化脫落[23]，從而促使黑色素排出。B16細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)60%醇提物具有抑制細(xì)胞增殖的作用，且在100 μg/mL濃度時(shí)抑制效果顯著，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，形態(tài)改變，子房提取物和熊果苷對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，以多巴為底物，熊果苷對(duì)酪氨酸酶有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以L-多巴為底物測(cè)定細(xì)胞內(nèi)酪氨酸二酚酶活性，藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物的抑制效果與熊果苷相當(dāng)，且其細(xì)胞增殖率較熊果苷低，細(xì)胞中黑素相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也為藍(lán)色整花體積分?jǐn)?shù)60%醇提物低于黃色，均比子房提取物效果好，添加熊果苷的黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，可知香水蓮花提取物能通過(guò)抑制酪氨酸酶活性及減少細(xì)胞增殖從而降低黑素生成量，表明香水蓮花提取物在美白方面具有較好的應(yīng)用前景。