王新鳳 張滕飛 程謙謙 李妍怡

【摘 要】 目的：提供制備大鼠局灶性缺血性腦損傷模型的方法。方法：SD雄性大鼠60只，體重260～280g，隨機(jī)分為空白對照組，假手術(shù)組，缺血性腦損傷再灌注組。缺血再灌注的時(shí)間點(diǎn)為1d、3d、7d、14d，每組各10只。頸部正中切口，采用從頸外動(dòng)脈插入線栓繞過頸總動(dòng)脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈的方法。用0.235mm魚線造成大鼠中動(dòng)脈血供阻斷（MCAO）2h。采用大體和組織學(xué)的觀察方法，研究腦組織梗死灶及血管的變化。結(jié)果：空白組和假手術(shù)組未見梗死灶，缺血性腦損傷再灌注組有梗死灶形成。結(jié)論：該線栓法制作缺血性腦損傷模型方法穩(wěn)定可靠，成功率高，死亡率低。

【關(guān)鍵詞】 線栓法；缺血性腦損傷；大鼠模型

【中圖分類號】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）05-0033-04

Abstract：Objective To provide a model for the preparation of focal cerebral ischemic brain injuire in rats. Methods 60 SD male rats， weight 260～280g， were randomly divided into blank control group， control group， the cerebral ischemic reperfusion injury group， Ischemia reperfusion time point for 1d， 3d， 7d， 14d. Each group of 10.Neck midline incision， use the insert line from the external carotid artery bolt to bypass the method of common carotid artery into the internal carotid artery bifurcation. With a 0.235mm line caused artery of rats in the block （MCAO） 2h. The gross and histological observation method， research on brain infarcts and the change of the blood vessels. Results Blank group and control group did not see infarcts，cerebral ischemic reperfusion injury group has formed infarcts. Conclusion Line bolt legal system for ischemic brain injury model method is stable and reliable， high success rate， low mortality rate.

Keywords：Line Plug Method；Lschemic Brain Injury；Rat Model

急性腦血管病又稱腦卒中，其發(fā)病率逐年上升，已成為第一大致殘病因和第二大致死病因。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[1]，我國每年新發(fā)腦卒中病例約有200萬，年腦卒中發(fā)病率約為（116～219） /10萬人口，年腦卒中死亡率約達(dá)到發(fā)病率的一半：（ 58～142 ） /10萬人口。腦卒中又可分為缺血性腦卒中（ischemic Stroke， IS）和出血性腦卒中（Hemorrhagic Stroke ）[2]，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中發(fā)病率的80%左右，并且其發(fā)病率隨年齡的增長而增高。因此，了解缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展和防止措施具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)使用線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈（Middle Celebral Artery，MCA）制作缺血性腦損傷的方法，制作成熟的大鼠缺血性腦損傷模型是該研究的基礎(chǔ)。然而，該模型的方法已有多種，在前人工作的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良和反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)合在其他實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)，現(xiàn)將本實(shí)驗(yàn)的造模過程和結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 SPF級SD雄性大鼠，60只，體重260～280g。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室，室溫（23±2）℃，濕度45%～55%，自由飲水處理原則。

1.2 材料 水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（批號：1114A029，北京索萊寶科技有限公司）；魚線（愛魚者德國原絲魚線）；微型動(dòng)脈夾（美萊醫(yī)療器械）；24孔板（海門市春博生物實(shí)驗(yàn)器械廠）。

2 方法

2.1 造模與分組 將直徑0.235mm的魚線用鋒利的手術(shù)刀片裁剪為長約3～4cm/段，用酒精燈將魚線一端輕微燒一下（目的把魚線頭端燒圓滑，切記把魚線頭端燒成釘子帽狀。）之后用黑色Marker筆，用刻度尺比量，從魚線頭端開始計(jì)算，距離18～20mm處對線栓做標(biāo)記。把制作好入選的線栓放入實(shí)驗(yàn)盒子內(nèi)備用。按照3～5mL/kg體重的量腹腔注射10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，待大鼠麻醉充分將大鼠平躺與手術(shù)操作臺(tái)上。術(shù)前常規(guī)消毒，在大鼠頸部正中處，從下頜下1.5～2cm開始，做一大約長為3cm左右的切口，之后小心剝離出大鼠的右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈三條動(dòng)脈分叉處，將頸外動(dòng)脈離心處永久性結(jié)扎，用微型血管夾夾住頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈向心處打一活結(jié)，用于固定線栓，在頸外動(dòng)脈活結(jié)和死結(jié)之間剪一小口，剪破血管時(shí)注意血管剪與血管之間呈45°角，剪口寬度不超過總血管的1/2。將準(zhǔn)備好的線栓從切口處插入頸外動(dòng)脈向心端，到達(dá)頸總動(dòng)脈與頸內(nèi)、外血管分叉處，繞過分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，此時(shí)剪斷頸外動(dòng)脈死結(jié)的向心處，取開頸內(nèi)動(dòng)脈的血管夾，調(diào)整線栓角度，順勢經(jīng)過頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈。在從頸總動(dòng)脈分叉處記起，線栓大約進(jìn)入18～20mm處時(shí)，線栓會(huì)受到輕微阻力，停止插線栓。扎緊在頸外動(dòng)脈向心處活結(jié)。2h后拔出線栓至頸總動(dòng)脈分叉處。待大鼠清醒后行模型評分，將制作成功的模型按照隨機(jī)數(shù)字表分組，根據(jù) 1d、3d、7d、14d分為四組，每組各10只。其中未活到預(yù)計(jì)天數(shù)者，隨時(shí)補(bǔ)充，保證每組10只。假手術(shù)組在下頜處打開切口，之后小心剝離出大鼠的右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈三條動(dòng)脈分叉處，不做任何處理，縫合切口。

2.2 觀察指標(biāo) 對各實(shí)驗(yàn)組大鼠采用Bederson[3]等0～5分評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。標(biāo)準(zhǔn)如下：0分-神經(jīng)功能完全正常，活動(dòng)自如；1分-對側(cè)（左前肢）肌力下降，呈內(nèi)收屈曲狀；2分-對側(cè)（左側(cè)）自主旋轉(zhuǎn)或劃圈，平地時(shí)；3分-對側(cè)（左側(cè)）傾倒，平地時(shí)；4分-昏睡或者昏迷的意識障礙；5分-大鼠的死亡。其中1-3分為成功模型。

2.3 標(biāo)本采集 取成功MCAO模型根據(jù)1d、3d、7d、14d行缺血再灌。采用10%水合氯醛按照3～4mL/kg的劑量對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待麻醉成功后，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物電動(dòng)剃須刀將麻醉成功的大鼠胸腹部的毛發(fā)剪去，將大鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢固定，常規(guī)消毒鋪巾，按照無菌原則手術(shù)操作；沿前正中線剪開皮膚、鈍性分離皮下組織，組織剪從胸骨柄正中剪開，使用止血鉗夾閉出血?jiǎng)用}止血，充分暴露大鼠心臟、主動(dòng)脈，從心尖處插入動(dòng)靜脈留置針（針頭內(nèi)包含針芯）至主動(dòng)脈根部，拔出針芯，連接輸液管，剪開右心耳，立即用含有肝素（10μ/mL）的生理鹽水行心臟灌注，待大鼠肝臟組織顏色變淡，且從右心耳出口流出的灌注液由紅色逐漸變淡并呈完全清亮為止。將大鼠俯臥于手術(shù)臺(tái)上，固定大鼠頭部、四肢，常規(guī)消毒鋪巾，按照無菌原則手術(shù)操作，沿頭部背側(cè)中線剪開皮膚，分離皮下組織，剝離骨膜，止血鉗咬除大鼠頂部顱骨，小心分離取出大鼠腦組織，取出置于-80℃冰箱保存留用。

2.4 MCAO再灌注模型HE染色 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色4min，流水沖洗，1%的鹽酸酒精溶液分化5s，流水沖洗，伊紅染色2min，水洗3次，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

2.5 MCAO再灌注模型TTC染色 ①TC染液的配置：用0.1mol/LpH7.5的磷酸緩沖液配制成0.5%濃度的TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑），并調(diào)溶液的pH到6.8～7.2。②切片：將在-20℃的冰箱中保存的腦子取出，一般切成5～6片， 每隔2mm 切一片。第1刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間，總共切6片。③將切片置于TTC 中， 37℃的30min，4%多聚甲醛固定12h。之后將數(shù)據(jù)輸入Image Pro Plus5.0軟件進(jìn)行處理，確定缺血部位的梗死面積。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣本組間均數(shù)差異的比較選用one-way ANOVE方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果 采用Bederson等0-5分評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)選取，2h、1d、3d、7d、14d。實(shí)驗(yàn)對象：每只成功模型大鼠。神經(jīng)功能評分隨著腦缺血再灌注的延長而慢慢恢復(fù)。結(jié)果是跟空白組比較，腦缺血再灌2h神經(jīng)功能評分3～4分（P<0.01）；1d神經(jīng)功能評分3分（P<0.01）；3d神經(jīng)功能評分2～3分（P﹤0.01）；7d神經(jīng)功能評分1～2分（P<0.05）；14d神經(jīng)功能評分0～1分（P>0.05）。結(jié)果如圖1所示。

3.2 MCAO模型再灌HE染色結(jié)果 空白對照組和假手術(shù)組HE染色切片呈紅色，缺血損傷再灌注組正常組織HE染色呈紅色，梗死灶呈白色，兩者界限明顯。正常組的細(xì)胞排列整齊，腦白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核飽滿無固縮，假手術(shù)組與之相比較無明顯變化。M1組染色逐漸變淺，腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，細(xì)胞核固縮并且細(xì)胞排列紊亂，隨時(shí)間增加表現(xiàn)明顯。M7組后染色相對清晰，腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸正常，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯減輕，細(xì)胞排列逐漸整齊。M14基本恢復(fù)正常。如圖2所示。

3.3 MCAO模型再灌TTC染色結(jié)果 成功的腦缺血再灌注模型因大腦中動(dòng)脈阻塞缺血而導(dǎo)致腦組織壞死，壞死的腦組織不能被TTC染色而呈現(xiàn)蒼白色，未缺血的部分被TTC染成紅褐色。如圖3所示。與正常組相比較，模型14d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），隨著時(shí)間增加，梗死面積逐漸增大，模型1d，3d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01），7d梗死面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。7d后梗死面積逐漸縮小。見表1。

4 討論

缺血性腦損傷發(fā)病率的逐年上升，引起了國內(nèi)外學(xué)者對其發(fā)病機(jī)制和治療方法的高度重視，作為該病研究的基礎(chǔ)，用線栓法制作成功的缺血性腦損傷模型具重要作用。應(yīng)用線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈造成缺血性腦損傷模型方法有多種，其后手術(shù)方法也有多種改進(jìn)，目的是為了手術(shù)創(chuàng)傷更小，操作更簡單，成功率高，死亡率低。之前最常用的造模方法是從頸總動(dòng)脈剪一“V”字行切口[4]，從頸總動(dòng)脈插入進(jìn)入大鼠大腦中動(dòng)脈。該方法雖然不用分離頸內(nèi)動(dòng)脈，在血管機(jī)械刺激方面較小[5]，但是該方法很難從頸總動(dòng)脈進(jìn)入大鼠大腦中動(dòng)脈，線栓大約進(jìn)入10mm處就不能進(jìn)入，期間調(diào)整角度，反復(fù)插入，反而加重?fù)p傷，增加死亡率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：從頸外動(dòng)脈插入繞過分叉路口進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈時(shí)更易進(jìn)入大鼠大腦中動(dòng)脈，解決了很多學(xué)者用之前的方法很難進(jìn)入大鼠大腦中動(dòng)脈而導(dǎo)致模型評分低和死亡率高的缺點(diǎn)。并且造模時(shí)間更短，效率更高，成功率高，完成一只動(dòng)物造模僅用10～15min，死亡率低至10%以下。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，造模2h后拔出魚線，隨時(shí)間增加梗死面積逐漸增大，但到7d后，梗死面積逐漸減小，到14d時(shí)神經(jīng)功能得到改善，故而說明，在發(fā)生缺血性腦損傷的同時(shí)，內(nèi)源性的代償機(jī)制也被觸發(fā)，此過程可見血管生成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)缺血性腦損傷機(jī)制和治療方面的研究提供基礎(chǔ)和思路。

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（收稿日期：2018-01-18 編輯：程鵬飛）