謝琳淼，常春麗，姚志紅，王洪瑞，趙冬雪，張榮沭，敖 紅

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

草地早熟禾(Poapratensis)根莖發(fā)達、分蘗能力極強且青綠期長，能迅速形成草叢密而整齊的草坪。此外，作為放牧型禾本科牧草，其放牧時間長，耐踐踏，營養(yǎng)價值高，是良好的家畜飼料[1-2]。紫羊茅(Festucarubra)是被廣泛應用的草坪植物，其壽命長，色美，可用于機場、花壇、庭院、林下等作觀賞用；亦可用于固土護坡、保持水土。由于上述優(yōu)點，這兩種草在我國北方地區(qū)及南方部分冷涼地區(qū)被廣泛應用于園林綠化及牧草種植[3-4]。

然而近年來由于土壤鹽堿化、干旱、重金屬污染等全球性的生態(tài)問題，使得草坪草、牧草種子大多存在萌發(fā)率低、出苗不整齊和幼苗抗逆性弱的現(xiàn)象，并且這一現(xiàn)象在我國北方地區(qū)表現(xiàn)尤為明顯[5-8]。因此，如何提高牧草及草坪草種子的出苗率，促進幼苗生長，提高草坪觀賞價值，提高牧草的產(chǎn)量和質(zhì)量是目前需要重點解決的問題。相比于采用周期長、見效慢的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)和土壤改良措施，開發(fā)和利用生物制劑提高牧草和草坪草的萌發(fā)率，促進幼苗生長，提高植株抗性是一種新思路和新方法[9-10]。

木霉(Trichodermaspp.)是一類自然界中分布廣泛的生防真菌，常見于植株殘體、土壤、根系、葉莖周圍等環(huán)境中[11-12]。有研究表明，綠木霉(T.virens)、康氏木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum)等代謝物可促進種子萌發(fā)，促進小麥(Triticumaestivum)胚芽鞘及玉米(Zeamays)、番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗的生長；增加根莖生物量[13-17]；此外木霉還具有誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的作用[18-19]。木霉的促生效應及生防效應在多種植物材料上得到證實，但有關(guān)木霉的研究多集中在農(nóng)作物和經(jīng)濟作物上，對牧草、草坪草促生方面的研究還較少。

本研究利用哈茨木霉孢子懸浮液對紫羊茅和草地早熟禾進行處理，通過對多個種子萌發(fā)指標、生長指標及生理生化指標的測定，研究哈茨木霉對兩種草的促生效應及抗性的誘導作用，以期為如何促進草坪草及牧草的生長、提高草坪質(zhì)量及適應性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試植物種子為草地早熟禾(公園‘Park’)和紫羊茅(夢神‘Rubra’)，2016年購于哈爾濱市和平綠化有限公司。

哈茨木霉(Trichodermaharzianum)Th62由東北林業(yè)大學園林學院張榮沭提供。

1.2 哈茨木霉提取液濃度設(shè)置

種子萌發(fā)試驗：結(jié)合預試驗設(shè)置4個哈茨木霉?jié)舛龋謩e為1×102、1×103、1×104、1×105cfu·mL-1，同時以蒸餾水作為對照(CK)。

盆栽試驗：結(jié)合預試驗設(shè)置哈茨木霉?jié)舛葹?×107cfu·mL-1。

1.3 試驗方法

種子萌發(fā)試驗：選取顆粒飽滿的種子，用0.1% KMnO4消毒15 min后，用自來水沖洗至無色，再用蒸餾水沖洗3～4遍，蒸餾水浸種2 h。取干凈的帶塞試管，每個試管內(nèi)放入等量供試草種，將配好的各濃度哈茨木霉提取液2 mL分別加入每個試管進行浸種[16]，每個處理3次重復，處理3 h。取90 mm培養(yǎng)皿，內(nèi)設(shè)雙層濾紙發(fā)芽床，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放入50粒經(jīng)過上述經(jīng)哈茨木霉浸種處理后的草種，每皿加蒸餾水3 mL，每個處理3次重復。放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，模擬自然條件，白天(16 h，25 ℃)，夜晚(8 h，15 ℃)。

盆栽試驗：將土滅菌后用濃度為1×107cfu·mL-1的哈茨木霉提取液拌土(每400 g土拌350 mL菌液)，同時用蒸餾水拌土作為對照。將兩個草種分別均勻的撒入盆中，并覆保鮮膜，促進種子發(fā)芽。每個處理3個重復。待幼苗長出2片展開葉時再補加一次哈茨木霉提取液，每盆150 mL，補澆哈茨木霉提取液3周后測定生長及各項生理指標。

1.4 測定方法

1.4.1種子萌發(fā)指標測定 按照《牧草種子檢驗規(guī)程》(GB/T 2930.4-2001)系列國家標準進行操作，記錄草地早熟禾28 d 內(nèi)的種子發(fā)芽數(shù)和紫羊茅21 d內(nèi)種子的發(fā)芽數(shù)[20]。本研究以胚芽長度達到種子長度一半作為種子萌發(fā)標志，并按如下公式計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)[21-22]。培養(yǎng)結(jié)束后用游標卡尺測定胚根、胚芽長度。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽勢=(達到發(fā)芽高峰期的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)。

式中：Gt為處理不同時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)(t=7 d)；

活力指數(shù)(VI)=GI×S。

式中：GI為發(fā)芽指數(shù)，S為一定時期內(nèi)的幼苗長度。

1.4.2生長及生理生化指標測定 地上部分生物量及植株相對含水量用常規(guī)方法測定[23]；可溶性糖含量測定采用蒽酮法[24]；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法；超氧化物歧化酶測定采用氮藍四唑(NBT)法；過氧化物酶測定采用愈創(chuàng)木酚法[25]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用Excel整理數(shù)據(jù)、制作相關(guān)圖表，用DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉對紫羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)的影響

一定濃度的哈茨木霉對兩種草的種子萌發(fā)有明顯的促進作用(圖1)。1×103及1×104cfu·mL-1的哈茨木霉處理后，草地早熟禾種子發(fā)芽率顯著高于對照(P<0.05)，其中哈茨木霉?jié)舛葹?×103cfu·mL-1時，草地早熟禾發(fā)芽率達到92.0%，比對照高16.9%。1×102、1×103及1×104cfu·mL-1的哈茨木霉顯著促進了紫羊茅種子的萌發(fā)(P<0.05)，其中1×104cfu·mL-1哈茨木霉處理后紫羊茅種子發(fā)芽率達到74.0%，比對照高18.1%。但當哈茨木霉?jié)舛葹?×105cfu·mL-1時，兩種草的種子萌發(fā)率與對照之間未見顯著差異(P>0.05)。

不同濃度的哈茨木霉對發(fā)芽勢的影響不同。對于草地早熟禾，哈茨木霉?jié)舛葹?×102cfu·mL-1時，其發(fā)芽勢開始上升，至1×104cfu·mL-1時，其發(fā)芽勢達到最大，為43.3%，比對照高8.0%。對于紫羊茅，哈茨木霉?jié)舛仍?×102及1×103cfu·mL-1時，其發(fā)芽勢變化不顯著；哈茨木霉?jié)舛葹?×104cfu·mL-1時，其發(fā)芽勢達到最大，為58.0%，比對照高6.3%，而當哈茨木霉?jié)舛冗_到1×105cfu·mL-1時，其發(fā)芽勢卻顯著低于對照(P<0.05)。

兩種草在哈茨木霉處理后種子的發(fā)芽指數(shù)變化趨勢基本相同(圖2)。哈茨木霉?jié)舛葹?×102cfu·mL-1時，草地早熟禾和紫羊茅種子的發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)；哈茨木霉?jié)舛葹?×104cfu·mL-1時，兩種草種子的發(fā)芽指數(shù)達到最大，草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)為10.23，紫羊茅種子發(fā)芽指數(shù)為11.85，與對照相比分別提高14.4%和18.6%，與對照間差異顯著(P<0.05)；哈茨木霉?jié)舛葹?×105cfu·mL-1時，兩種草的發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照。

對活力指數(shù)的測定結(jié)果顯示，濃度為1×103、1×104及1×105cfu·mL-1的哈茨木霉提取液均能顯著提高紫羊茅種子的活力指數(shù)(P<0.05)，且1×104cfu·mL-1的哈茨木霉提取液的效果最為明顯。在1×102cfu·mL-1哈茨木霉處理后草地早熟禾種子的活力指數(shù)顯著下降，1×104cfu·mL-1處理后顯著提高，其他濃度處理后效應并不顯著(P>0.05)。

圖1 哈茨木霉對紫羊茅及草地早熟禾種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響Fig. 1 Effect of Trichoderma harzianum on the germination rate and germination vigor of Festuca rubra and Poa pratensis

同一植物不同小寫字母表示不同哈茨木霉?jié)舛乳g差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Different lowercase letters within the same test material indicate significant differences among different concentrations ofT.harzianumat the 0.05 level; similarly for the following figures.

圖2 哈茨木霉對紫羊茅及草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Fig. 2 Effect of Trichoderma harzianum on the germination index and vigor index of Festuca rubra and Poa pratensis

各濃度的哈茨木霉對草地早熟禾和紫羊茅的胚芽長度均有促進作用(圖3)，均顯著大于對照(P<0.05)，且隨著哈茨木霉?jié)舛仍黾?，其胚芽長度總體呈上升趨勢。哈茨木霉?jié)舛葹?×105cfu·mL-1時，草地早熟禾種子的胚芽最長，為3.51 cm，較對照增加44.4%；紫羊茅種子的胚芽最長，為7.71 cm，較對照增加40.2%。

同樣各濃度的哈茨木霉處理對兩種草的胚根長度均有促進作用。在哈茨木霉處理濃度達到1×105cfu·mL-1時，草地早熟禾種子胚根最長，為3.14 cm，比對照顯著增加53.9%(P<0.05)；紫羊茅種子胚根最長，為5.45 cm，比對照顯著增加64.7%(P<0.05)。

2.2 哈茨木霉對紫羊茅及草地早熟禾生長的影響

1×107cfu·mL-1哈茨木霉對兩種草株高均有促進作用(表1)，處理與對照間差異顯著(P<0.05)，哈茨木霉處理后草地早熟禾和紫羊茅株高較對照分別增加4.29和3.89 cm。此外，哈茨木霉處理顯著增加了兩種草的相對含水量及生物量(P<0.05)。哈茨木霉處理后草地早熟禾和紫羊茅的相對含水量較比對照分別增加9.85%和7.12%，生物量較對照分別增加了56.10%和50.28%。

2.3 哈茨木霉對紫羊茅和草地早熟禾生理特性的影響

哈茨木霉處理后，草地早熟禾和紫羊茅葉片脯氨酸含量分別較對照上升14.0%、160.1%；可溶性糖含量較對照分別上升7.3%、76.0%，且兩種草對照與處理間差異均達到顯著水平(P<0.05)。哈茨木霉處理后，草地早熟禾的可溶性蛋白含量較對照提高2.14%，但差異不顯著(P>0.05)，紫羊茅的可溶性蛋白含量較對照提高5.68%，差異顯著(P<0.05)。

哈茨木霉處理后，兩種草中超氧化物歧化酶(SOD)的活性均顯著提高(P<0.05)，與對照相比，紫羊茅和草地早熟禾分別提高45.6%和27.1%。從酶活性提高的程度看，哈茨木霉對過氧化物酶(POD)的影響相對較小，紫羊茅的對照和處理間差異未達到顯著水平(P>0.05)，但草地早熟禾過氧化物酶活性在哈茨木霉處理后與對照相比提高8.8%，且差異顯著(P<0.05)。

圖3 哈茨木霉對紫羊茅及草地早熟禾胚芽長度和胚根長度的影響Fig. 3 Effect of Trichoderma harzianum on plumule length and radicle length of Festuca rubra and Poa pratensis

種名 Species哈茨木霉?jié)舛萒. harzianum concentration/(cfu·mL-1)生物量Biomass/g株高Plant height/cm相對含水量Relative water content/%草地早熟禾Poa pratensis0(CK)0.08±0.00b22.28±2.10b78.91±2.13b1×1070.13±0.00a26.57±2.70a86.68±0.79a紫羊茅Festuca rubra0(CK)0.10±0.01b18.46±1.12b86.85±0.44b1×1070.13±0.01a22.35±1.92a93.03±2.19a

同列不同小寫字母表示處理與對照間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant differences between the treatments and the control (CK) at the 0.05 level.

圖4 哈茨木霉處理對兩種草葉片脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of Trichoderma harzianum on the contents of proline, soluble sugar, and soluble protein in leaves of Festuca rubra and Poa pratensis

圖5 哈茨木霉對兩種草葉片中SOD和POD活性的影響Fig. 5 Effect of Trichoderma harzianum on the activities of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in leaves of Festuca rubra and Poa pratensis

3 討論和結(jié)論

有研究表明，木霉可以促進多種植物的種子萌發(fā)和幼苗生長[13,16,21]，這與本研究的結(jié)果一致。本研究中，哈茨木霉?jié)舛葹?×104cfu·mL-1時，對兩種草種子的萌發(fā)均有明顯的促進作用，兩種草的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均達到最大值，并且在(1×102)～(1×105) cfu·mL-1范圍內(nèi)，隨著哈茨木霉?jié)舛鹊脑黾?，兩種草幼苗的胚根、胚芽長度也顯著增加，說明一定濃度的哈茨木霉可以使兩種草種子發(fā)芽快、發(fā)芽整齊，并且使幼苗生長迅速。

木霉促進種子萌發(fā)、生長的機制有多方面。有研究顯示，木霉代謝過程中能夠產(chǎn)生多種生長素類物質(zhì)，如吲哚乙酸、吲哚乙醛和吲哚乙醇等[15]。生長素作為信號物質(zhì)與受體結(jié)合后，會啟動負責降解蛋白的SCF(SKP1/cullin/F-box)降解下游的生長素反應負調(diào)控元件AUX/IAA，激活生長素響應因子ARFs，從而啟動相關(guān)基因表達，表現(xiàn)出促進種子萌發(fā)和伸長生長的效應[26]。另外，由于種子萌發(fā)需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，有學者從營養(yǎng)角度分析木霉的促進機制。朱衍杰等[27]研究指出，當將國槐(Sophorajaponica)的種子用康寧霉素浸種后，可以顯著減少種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的外滲，從而使種子內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)更好地用于種子萌發(fā)及幼苗生長。本研究中當哈茨木霉?jié)舛容^低(1×102cfu·mL-1)和較高(1×105cfu·mL-1)時，兩種草的發(fā)芽指數(shù)均下降，這可能與哈茨木霉代謝產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不足有關(guān)，也可能與哈茨木霉由于自身生長繁殖的需要與植物間存在營養(yǎng)競爭有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，在土壤中施加1×107cfu·mL-1哈茨木霉后，植株的株高、生物量顯著提高。這種促生效應除了生長物質(zhì)的作用外，還可能與木霉的根際能力及植物的營養(yǎng)狀況有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，木霉在植物根際定植后，有效地改善了植物根系的微環(huán)境，一方面可以通過分泌有機酸使土壤中難溶或微溶的營養(yǎng)元素溶解度加大，另一方面還可以產(chǎn)生某些還原酶促進植物對氧化型礦質(zhì)元素的吸收[28-29]。另有研究發(fā)現(xiàn)，長枝木霉能夠提高6種牧草幼苗的根系活力及蛋白質(zhì)和可溶性糖含量[30]；哈茨木霉能夠提高豇豆(Vignaunguiculata)葉片內(nèi)蛋白質(zhì)含量，增強根系活力，從而促進豇豆的生殖生長[31]，上述結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。哈茨木霉處理后，兩種草葉片中可溶性糖、脯氨酸含量上升，且與對照間差異顯著，紫羊茅中可溶性蛋白的含量也顯著升高?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍准鞍被嶙鳛楸匦璧奶荚春偷礊橹参锷L和發(fā)育提供必需的物質(zhì)和能量[32]，因而這幾種物質(zhì)的增加有利于促進植物的生長。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)哈茨木霉可以增強植物根系的吸水能力，提高植物的相對含水量，更好地滿足植物生長對水分的需求。當然由于木霉促進植物生長的機制較為復雜，不同木霉菌株對不同植物生長的促進作用及機理各不相同，因此對哈茨木霉的促生機理還需從更多方面進一步研究。

施用哈茨木霉后脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量增加其意義是多方面的。一方面這些物質(zhì)可作為營養(yǎng)物質(zhì)促進植物的生長，另一方面它們還可作為細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，起著調(diào)節(jié)細胞滲透平衡、增強細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和減少組織氧自由基產(chǎn)生的重要作用[33]。因此這些物質(zhì)含量的提高，可以增強細胞的持水力，穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，減少植物脅迫條件下細胞的致死機會[34]。超氧化物歧化酶和過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除細胞內(nèi)在逆境下產(chǎn)生的活性氧，因而可以反映植物的抗逆性。劉連妹等[35]研究表明，哈茨木霉的孢子懸浮液可提高番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗葉片中超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性。本研究中，經(jīng)1×107cfu·mL-1哈茨木霉處理后，兩種草超氧化物歧化酶的活性顯著提高，草地早熟禾過氧化物酶活性顯著提高，說明一定濃度的哈茨木霉可通過提高保護酶活性來提高植物的抗逆能力。

綜合各項測定指標可以看出，1×104cfu·mL-1哈茨木霉可以顯著促進紫羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長；1×107cfu·mL-1哈茨木霉可以通過增加營養(yǎng)物質(zhì)的含量促進兩種草的營養(yǎng)生長，同時可以通過提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶的活性及多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量增強植株的抗性。