梅顯斌，阮麗萍

(四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

近年來，為減輕化療對癌癥患者的毒副作用[1-2]，研究者們開發(fā)了多種藥物控釋系統(tǒng)[3-4]，介孔硅因其獨(dú)特優(yōu)勢而成為理想的藥物控釋載體[5-6]。谷胱甘肽(GSH)具備較強(qiáng)的還原性，很容易切斷二硫鍵。研究表明，人類癌細(xì)胞內(nèi)GSH的常見濃度為10 mmol/L，顯著高于其在細(xì)胞外的濃度(2～10μmol/L)[3-7]。這種明顯的差異性為氧化還原刺激響應(yīng)體系的構(gòu)建提供了必要的條件，研究者們已經(jīng)設(shè)計(jì)出了多種基于GSH還原二硫鍵而實(shí)現(xiàn)藥物控釋的控釋系統(tǒng)，但這些控釋系統(tǒng)多采用高分子聚合物作為封堵分子，雖效果良好但其合成復(fù)雜[8-10]。

多肽是人體內(nèi)普遍存在的一類非常重要的生物活性物質(zhì)，多肽具有生物相容性好，易生物降解，降解產(chǎn)物對機(jī)體無二次傷害等優(yōu)點(diǎn)[11]，因此是一種理想的閥門分子，目前已報(bào)道的基于肽的控釋閥門多是利用長鏈肽的自組裝實(shí)現(xiàn)封堵，其合成也較為復(fù)雜。因此，本文擬在MCM-41型介孔硅上修飾二硫鍵，在二硫鍵另一端修飾只有兩個(gè)氨基酸的二肽，末端氨基酸為含有疏水吲哚結(jié)構(gòu)的色氨酸，并以二肽為“錨點(diǎn)”，通過β-CD的內(nèi)部疏水空腔包絡(luò)肽形成“納米塞”實(shí)現(xiàn)對孔道的封堵。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 二肽修飾的介孔硅的制備

首先，按照文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法略微調(diào)整后制備了MCM-41型介孔硅，巰基(-SH)修飾的介孔硅MCM41-SH 以及半胱氨酸(Cys)修飾的介孔硅MCM41-S-S-Cys。接著進(jìn)一步與色氨酸(Trp)反應(yīng)制得二肽修飾的介孔硅納米顆粒MCM41-S-S-Cys-Trp，具體方法如下：在燒瓶里將40 mg 色氨酸(Trp)分散在2 mL 的MES 緩沖液(pH值=6.0,0.1mol/L)中，然后加入適量的DMSO使色氨酸溶解，再加入40 mg的EDC.HCl和20 mg的SULFO-NHS，室溫下攪拌30min。40mg的MCM41-S-S-Cys分散于2 mL 的pH值=7.4的PBS緩沖液，然后將分散液加入到燒瓶中，室溫下攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液高速離心(10000 r/min，15min)，分離出顆粒，然后用去離子水洗滌顆粒3次，得到二肽修飾的介孔硅MCM41-S-S-Cys-Trp。

1.2 納米顆粒(MCM41-S-S-Cys-Trp)負(fù)載亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用亞甲基藍(lán)(MB)作為模擬藥物。取濃度為1×10-3mol/L的MB水溶液750μL與10 mg的納米顆?；旌暇鶆?，然后放在50℃水浴中加熱2 h后關(guān)加熱，常溫下過夜。次日取5 mg 負(fù)載MB的納米顆粒，加入5 mg β-CD后繼續(xù)攪拌10 h，之后用去離子水洗4次。最后一次洗滌后，用200μL水溶解納米顆粒，然后裝到截留分子量為14kDa的半透膜里，將其放入25 mL 燒瓶后加入15 mL去離子水緩慢磁力攪拌，每天換3次水，洗2天，最后一次換水后加15 mL水過夜。

1.3 載藥納米顆粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)

先取3 mL燒瓶內(nèi)液體測量吸光度，每隔10min取一個(gè)點(diǎn)，測量完吸光度后馬上倒入燒瓶內(nèi)，取6個(gè)點(diǎn)，完成后加入稱量好的GSH粉末(溶液中GSH濃度為10 mmol/L)，然后每10min取釋放液測試吸光度，測量完盡快倒回體系中，連續(xù)測量4 h。最后通過作標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度值換算成濃度值。

1.4 材料結(jié)構(gòu)表征

高分辨透射電子顯微鏡(TEM 為JEM-2100Plus 型)；N2吸附-脫附實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)比表面積及孔隙分析儀(Micromeritics-TristarII3020 型)，樣品在110 ℃下脫氣12 h 后在77K下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用BET-BJH 方法計(jì)算比表面積和孔徑；Zeta 電位采用納米粒度電位分析儀(Zetasizer Nano 型)；熱失重分析儀(TGA): HCT-2 型，升溫速率10℃/min，載氣為氮?dú)?，測量溫度范圍為100～700℃；吸光度用UV-1800PC紫外/可見分光光度計(jì)測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面肽修飾后的介孔硅納米顆粒的形貌分析

圖1 MCM41-S-S-Cys-Trp的TEM照片

采用高倍率透射電子顯微鏡(TEM)對制備的介孔硅納米顆粒MCM41-S-S-Cys-Trp形貌進(jìn)行了觀察。從圖1可以看到，MCM41-S-S-Cys-Trp為橢球形粒子，表面有明顯的介孔，粒子尺寸大小為110nm左右。顆粒之間有部分交聯(lián)的現(xiàn)象，這可能是由于介孔硅表面修飾的肽之間存在正負(fù)電荷的吸引力和苯環(huán)之間的疏水作用引起的，可見介孔硅納米顆粒在修飾多肽后并未對介孔結(jié)構(gòu)造成影響。

2.2 介孔硅納米顆粒表面修飾基團(tuán)的結(jié)構(gòu)鑒定

在圖2中可見，MCM-41在修飾不同基團(tuán)前后，對應(yīng)的紅外譜圖都出現(xiàn)了不同的峰位變化，但是作為本體的MCM-41特征峰沒有發(fā)生很大變化。在波數(shù)3000～3700 cm-1之間，都存在著一個(gè)較寬的吸收峰，這是硅羥基(Si-OH)的伸縮振動(dòng)峰。由于修飾巰基后MCM-41表面形成Si-O-Si鍵，使得硅羥基數(shù)量減少，所以在波數(shù)為3000～3700 cm-1之間的吸收峰強(qiáng)度不高；在波數(shù)1081 cm-1附近的一個(gè)相對較寬又較尖銳的吸收峰，應(yīng)是MCM-41內(nèi)、外表面上的硅氧四面體(SiO4)反對稱伸縮振動(dòng)峰；波數(shù)在500～1000 cm-1之間的幾個(gè)吸收峰，歸屬于硅氧四面體的骨架振動(dòng)譜帶。以上結(jié)果說明在對MCM-41改性的過程中并沒有破壞其主體結(jié)構(gòu)。從圖2(a)可知，將巰基(-SH)接枝到二氧化硅表面后，其FTIR光譜顯示出1450 cm-1和2935 cm-1的新譜帶，這分別屬于-CH2-中的C-H伸縮振動(dòng)和C-H不對稱彎曲振動(dòng)特征峰。此外，在2565 cm-1處出現(xiàn)了巰基吸收帶，這更是直接表明了巰基(-SH)修飾成功。從圖2(b)中FTIR譜圖可見，2565 cm-1處的巰基吸收峰消失，而在1584 cm-1和1564cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)新的峰，這歸屬于芳環(huán)(骨架譜帶)的伸縮振動(dòng)，并且2930 cm-1處的峰表明-CH2- 的存在，這表明顆粒上存在吡啶環(huán)，說明MCM41-S-S-pridine制備成功。如圖2(c)FTIR譜圖所示，MCM41-S-S-Cys中，1584 cm-1和1564 cm-1處的兩條譜帶消失。與此同時(shí)，在1340 cm-1處出現(xiàn)了新譜帶，這屬于C-N伸縮振動(dòng)，在1749 cm-1處的新譜帶屬于羰基中的C=O，這說明Cys接枝成功。從圖2(d)中可見，在修飾色氨酸后出現(xiàn)了幾個(gè)新的譜帶。在1770 cm-1處出現(xiàn)的譜帶屬于羰基中的C=O伸縮振動(dòng)，1650 cm-1處的新譜帶屬于N-H不對稱彎曲震動(dòng)峰，此外，在1458 cm-1和1525 cm-1處有兩個(gè)新的譜帶是由苯環(huán)中的C=C骨架振動(dòng)引起的，這說明MCM41-S-S-Cys與色氨酸的?；磻?yīng)成功，制得MCM41-S-S-Cys-Trp納米粒子。

(a)脫模后MCM41-SH，(b)MCM41-S-S-pridine，(c)MCM41-S-S-Cys，(d)MCM41-S-S-Cys-Trp

圖2 紅外光譜

Fig.2 FT-IR spectra

2.3 表面修飾不同基團(tuán)后的介孔硅納米顆粒的Zeta電位

從表1和圖3中可以看出，修飾了巰基的MCM41-SH顯負(fù)電，其Zeta 電位值為-24.2 mV，這是因?yàn)閹€基(-SH)在水中帶負(fù)電。而帶有吡啶環(huán)的MCM41-S-S-pridine的電負(fù)性增大至-26.8 mV，這是由于吡啶環(huán)上的氮原子的電負(fù)性較大所致。MCM41-S-S-Cys 納米粒電負(fù)性降低至-22.2 mV，這是因?yàn)樾揎椀陌腚装彼岷邪被汪然?，其等電點(diǎn)為5.05，因此，MCM41-S-S-Cys 納米粒在水溶液中表現(xiàn)為帶負(fù)電。而與MCM41-S-S-pridine相比，MCM41-S-S-Cys 納米粒缺少了帶負(fù)電的吡啶環(huán)和增加了帶正電的氨基，因此，其電負(fù)性降低。進(jìn)一步修飾了色氨酸的MCM41-S-S-Cys-Trp電位值較MCM41-S-S-Cys變化不大，這是因?yàn)樵瓉淼陌腚装彼崤c新引入的色氨酸均含有氨基和羧基，兩種氨基酸之間會(huì)發(fā)生酰胺化反應(yīng)形成酰胺鍵，反應(yīng)后體系仍然存在相當(dāng)數(shù)量的氨基和羧基，MCM41-S-S-Cys-Trp帶電荷的基團(tuán)變化不大，因此，二者電位值變化也很小。

表1 介孔硅納米粒子接枝化學(xué)基團(tuán)后的Zeta 電位值

圖3 介孔硅納米粒子接枝不同基團(tuán)后的Zeta電位變化趨勢

Fig.3 The trend of Zeta-potential of MSNs after grafting with chemicals at each step

2.4 脫模后介孔硅納米顆粒的介孔性質(zhì)表征

通過N2吸附-脫附法對脫模后的介孔硅納米粒MCM41-SH的比表面積、孔容積和孔徑大小及分布情況進(jìn)行測定，相關(guān)數(shù)據(jù)見表2，吸附-脫附曲線及孔徑分布圖見圖4。從圖4中可見，該吸附平衡等溫曲線屬IUPAC分類中的IV型，H1滯后環(huán)，與典型的MCM41型介孔材料相同。納米顆粒在低壓段吸附量平緩增加，此時(shí)N2分子經(jīng)歷了從單層到多層吸附在介孔的內(nèi)表面，隨著相對壓力P/P0的不斷增加，N2的吸附量也在增加。MCM41-SH在相對壓力P/P0在0.3～0.4之間吸附曲線與脫附曲線出現(xiàn)比較明顯的突躍且兩條曲線距離很窄，表明含有介孔結(jié)構(gòu)，且孔的均一性很好，這也與圖中的孔徑分布相一致，說明改性后的納米顆粒介孔結(jié)構(gòu)仍然存在。通過計(jì)算，MCM41-SH的比表面積高達(dá)1051.8 m2/g，BJH孔容積為1.00 cm3/g，孔徑分布較窄，平均孔徑為3.4 nm。

表2 MCM41-SH介孔硅納米粒子的比表面積、孔容積和孔徑值

圖4 MCM41-SH納米粒子的N2吸附-脫附等溫曲線和BJH孔徑分布

Fig.4 Nitrogen adsorption and desorption isotherms and pore size distribution of samples MCM41-SH

2.5 表面修飾后的介孔硅納米顆粒的TG分析

圖5 MCM41-SH,MCM41-S-S-pridine,MCM41-S-S-Cys 和MCM41-S-S-Cys-Trp的熱重曲線

從圖5可見，巰基修飾的MCM41-SH在測試區(qū)間的失重為11.2%，這主要是因?yàn)樵诮榭坠璞砻娴膸€基的硅烷偶聯(lián)劑因高溫失重而引起的。對MCM41-S-S-pridine而言，其在測試區(qū)間的失重增加至15.9%，這與其結(jié)構(gòu)增加了硫和吡啶，有機(jī)物含量增加有關(guān)。從圖5可看出，MCM41-S-S-Cys在測試區(qū)間的失重進(jìn)一步增加至19.3%，這是因?yàn)樾揎棸腚装彼岷?，納米粒子中的有機(jī)物比重增加，當(dāng)溫度上升后有機(jī)物失重，造成失重增加。MCM41-S-S-Cys-Trp在測試區(qū)間的失重量均高于前面三種納米粒，失重量增加至22.1%，這是因?yàn)樵贛CM41-S-S-Cys上接枝了色氨酸，納米粒子的有機(jī)物比重進(jìn)一步增加，從而引起測試區(qū)間的失重值進(jìn)一步增加。熱失重分析的結(jié)果說明了我們在對介孔硅改性的過程中，每一步反應(yīng)均取得成功。

2.6 介孔硅納米藥物控釋系統(tǒng)釋放藥物的定量分析

亞甲基藍(lán)(MB)具有水溶性好，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易水解，便于檢測等優(yōu)點(diǎn)，其直徑約為1.1～1.2 nm，在水溶液中帶正電荷，是理想的模擬藥物。以1 mmol/LMB載藥的控釋系統(tǒng)記為MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD，并測定了該控釋系統(tǒng)在無GSH和在10 mmol/L GSH刺激下在不同時(shí)間點(diǎn)的釋放，結(jié)果如圖6所示。

在圖6中0～60min 內(nèi)的5個(gè)點(diǎn)屬于無GSH環(huán)境下的平衡數(shù)據(jù)，是該藥物控釋系統(tǒng)在純水中浸泡12 h后的累計(jì)洗出量，并且在測量的1 h內(nèi)其濃度值沒有明顯變化，說明“納米塞”能有效的將MB封堵在孔道內(nèi)，幾乎無泄漏。當(dāng)在第60min時(shí)，加入GSH使控釋體系環(huán)境中的GSH濃度達(dá)到10 mmol/L后，釋放液中的MB濃度值明顯升高，第70min時(shí)的濃度值以達(dá)無GSH時(shí)的6倍，此后，隨著藥物不斷地從孔道內(nèi)釋放出來，體系中的MB濃度值繼續(xù)升高。在第240min以后，釋放曲線趨于平緩，說明控釋系統(tǒng)中MB的釋放接近結(jié)束，最終在第300min時(shí)MB濃度值到達(dá)最初的22倍之多。以上結(jié)果說明GSH促使控釋系統(tǒng)MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD實(shí)現(xiàn)藥物釋放，結(jié)合其控釋機(jī)理，只有封堵孔口的“納米塞”被移除后，孔道內(nèi)的MB才能快速釋放出來。由此可以說明，在介孔硅納米藥物控釋系統(tǒng)MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD中，β-CD與二肽形成的“塞納米塞”能有效封堵孔口，而當(dāng)體系中存在10 mmol/L GSH時(shí)，連接肽的二硫鍵被打斷，使得肽和β-CD一同脫離介孔硅表面，孔口被打開，孔道內(nèi)的MB得以釋放出來，實(shí)現(xiàn)了對藥物的可控釋放。

圖6 納米藥物控釋系統(tǒng)MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD的釋放曲線

3 結(jié)論

在MCM-41型介孔硅表面修飾了對GSH響應(yīng)的二硫鍵及生物相容性優(yōu)良的二肽小分子。以亞甲基藍(lán)為模擬藥物進(jìn)行控釋實(shí)驗(yàn)，以β-CD包絡(luò)二肽的“納米塞”在無GSH刺激時(shí)能保持良好的封堵能力，無亞甲基藍(lán)釋放，而當(dāng)在10mmol/L GSH刺激下，能快速釋放負(fù)載的大量亞甲基藍(lán)，釋放量為無GSH刺激的22倍。以上結(jié)果表明“納米塞”具有良好的控制-釋放性能，在藥物控釋方面具有應(yīng)用潛力。