陳志寬 劉蘭蘭 梁銳晶 何華美 鄭明彬,3 蔡林濤

1(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

3(廣東醫(yī)科大學(xué) 東莞 523808)

1 引 言

光動力治療(Photodynamic Therapy，PDT)因其毒副作用小、非侵襲性、高度時空選擇性等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于鱗狀細胞癌、食管癌、膀胱癌等多種癌癥的治療，是一種具有重要臨床應(yīng)用前景的腫瘤治療策略[1]。光敏劑被激光激發(fā)后將氧氣轉(zhuǎn)化成具有細胞毒性的活性氧，從而產(chǎn)生高效的腫瘤細胞殺傷效果[2]。盡管 PDT 在腫瘤治療中展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢，但仍然存在許多不足。一方面，大部分光敏劑難溶于水，生物利用率差和腫瘤富集量低[3]。另一方面，實體瘤嚴(yán)重缺氧，使得 PDT 效果受到了限制[4,5]。因此，開發(fā)能高效包載光敏劑并具有自供氧能力的藥物遞送體系，對增強 PDT 療效具有重要意義。

蛋白質(zhì)具有良好的生物相容性、生物穩(wěn)定性、功能與結(jié)構(gòu)多樣性，已成為載藥、增氧、靶向等納米藥物遞送平臺的重要材料[6-8]。人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)作為人體內(nèi)源性蛋白，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。該蛋白具有藥物分子結(jié)合能力強、安全性高、主動靶向性強、體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性好且半衰期長等優(yōu)點，在眾多納米載藥系統(tǒng)中具有巨大的優(yōu)勢[8,9]。血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)作為血液中紅細胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)氧氣的運載，為機體的組織和細胞供氧。得益于 Hb 天然的載氧能力和良好的生物相容性，Hb 類氧載體作為一類血液替代品已應(yīng)用于臨床[10]，其在腫瘤治療的應(yīng)用也日益受到關(guān)注[11,12]。據(jù)報道，將兩種功能各異的蛋白質(zhì)合成雜交蛋白納米組裝體，能在一個體系中同時實現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)分子生物功能[13,14]。因此，構(gòu)建包載光敏劑的 HSA/Hb 雜交蛋白納米氧載體有望成為一種能實現(xiàn)腫瘤靶向和增強 PDT 療效的新策略。

研究發(fā)現(xiàn)，放射治療、光動力治療、某些化療藥物(如蒽環(huán)類藥物)能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生“免疫原性細胞死亡”。其中，免疫原性細胞死亡依賴一類被稱作“損傷相關(guān)分子模式”的免疫刺激信號分子(如鈣網(wǎng)蛋白、高遷移率族蛋白 B1 和三磷酸腺苷等)的釋放來激活和募集抗原遞呈細胞，隨后活化 T 細胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答[15]。研究癌癥療法的免疫原性細胞死亡誘導(dǎo)情況，對評估癌癥治療療效、優(yōu)化治療策略具有重要意義。因此，本研究利用性能優(yōu)異的 HSA、天然載氧蛋白 Hb 以及光敏劑 Ce6 為材料，通過二硫鍵共價偶聯(lián)的方法構(gòu)建包載 Ce6 的雜交蛋白氧載體(C@Hb/HSA)，并以結(jié)腸癌細胞系(CT26.WT)為研究模型，考察其體外 PDT 效應(yīng)，探討 C@Hb/HSA 介導(dǎo)的PDT 能否誘導(dǎo) CT26.WT 細胞產(chǎn)生免疫原性細胞死亡。

2 材料與方法

2.1 材料

人血清白蛋白(HSA)購自美國 Sigma 公司；血紅蛋白(Hb)和谷胱甘肽均購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；光敏劑 Ce6 購自北京百靈威科技有限公司；鼠源結(jié)腸癌細胞(CT26.WT)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；RPMI-1640 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液均購自美國 Hyclone公司；X-Vivo15 培養(yǎng)基購自瑞士 Lonza 公司；粒細胞巨噬細胞刺激因子、白細胞介素-4 均購自美國 PeproTech 公司；胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自美國 Gibco 公司；活性氧熒光探針(2′, 7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯，DCFHDA)購自美國 Sigma-Aldrich 公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔源的 antimouse calreticulin、anti-rabbit-Alexa Fluor 488 抗體均購自美國 Life technologies 公司；anti-mouse MHC II-PE、anti-mouse CD86-Percp 抗體均購自美國 eBioscience 公司；6 周齡 BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物中心。所有操作均符合中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院動物倫理管理協(xié)議(SIAT-IRB-160223-YYS-ZMB-A0185)的要求。

2.2 實驗方法

2.2.1 C@Hb/HSA 納米顆粒的制備

首先，將 HSA 與還原劑——谷胱甘肽按3∶1 的質(zhì)量比共溶于去離子水中(HSA 的濃度為 60 mg/mL)，在室溫下攪拌反應(yīng) 1 h。然后，采用透析法除去反應(yīng)溶液中過量的谷胱甘肽分子，得到還原后的 HSA 溶液。接著，將還原后的 HSA 溶液與預(yù)處理的 Hb 溶液、Ce6 溶液(溶于二甲基亞砜)混合，使 HSA、Hb、Ce6 的質(zhì)量比為 50∶9∶1。溶液充分混合后，將 pH 調(diào)節(jié)至8.0，在劇烈攪拌的條件下，迅速加入 1.5 倍體積的無水乙醇溶液，室溫攪拌反應(yīng) 30 min。最后，反應(yīng)溶液通過超濾法(超濾膜截留分子量為 100 kD，離心轉(zhuǎn)速為 4 500 rpm)除去乙醇、游離的 Ce6、Hb 和 HSA，即得 C@Hb/HSA 納米顆粒。

2.2.2 C@Hb/HSA 納米顆粒的表征

C@Hb/HSA 的粒徑分布、表面電位由Zetasizer Nano ZS 粒度儀(Malvern)在室溫下測得。C@Hb/HSA 的形貌通過透射電子顯微鏡(FEI Tecnai G2 F20 S-Twin)進行表征。采用紫外/可見分光光度計(Perkin-Elmer Lambda25)測定C@Hb/HSA 的紫外-可見吸收光譜。C@Hb/HSA的氧釋放曲線測定方法如下：C@Hb/HSA 充氧后，將 1 mL 的 C@Hb/HSA (相應(yīng) Hb 濃度為4 mg/mL)注入體積為 10 mL 的低氧水溶液中，插入溶氧儀探頭(Mettler Toledo)后立刻用乙酸乙酯液封，記錄不同時間點測得的溶氧濃度，并計算其與本底溶氧濃度的差值。

2.2.3 小鼠 CT26.WT 細胞的培養(yǎng)

選用鼠源的結(jié)腸癌細胞系 CT26.WT 來開展細胞實驗，CT26.WT 細胞用 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基(含有 10% 胎牛血清，1% 雙抗)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37℃、5% CO2。

2.2.4 小鼠樹突狀細胞的分離與培養(yǎng)

BALB/c 小鼠采用頸椎脫臼處死，用 75% 乙醇浸泡消毒后，無菌條件下，取出小鼠的脛骨和股骨，置于含有 2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中，并用 1 mL 注射器吸取含血清的磷酸鹽緩沖液將脛骨和股骨內(nèi)的骨髓細胞吹出。細胞吹散后，用 200 目的篩網(wǎng)過濾并收集于 15 mL 的離心管內(nèi)，4℃、1 400 rpm 下離心 5 min，往細胞沉淀中加入 1 mL 紅細胞裂解液，室溫裂解 1 min，然后加入 3 mL RPMI-1640 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。低速離心后，細胞置于含 10% 胎牛血清、鈣鎂離子的 RPMI-1640 中貼壁 6 h。收集未貼壁細胞，低速離心后，細胞重懸于 X-Vivo15 培養(yǎng)基(含 10 ng/mL 白細胞介素-4、20 ng/mL 粒細胞巨噬細胞刺激因子、20% 腫瘤細胞培養(yǎng)上清)，并接種到 24 孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第 4 天時，用新鮮的 X-Vivo15 培養(yǎng)基進行半量換液。培養(yǎng)至第6 天時，收集懸浮未貼壁的細胞，即為小鼠未成熟的樹突狀細胞。補充新鮮的培養(yǎng)基，重新接種后，便可用于后續(xù)實驗。

2.2.5 細胞毒性實驗

為了研究 C@Hb/HSA 的體外 PDT 效果，CT26.WT 細胞以 8×103個/孔的密度接種于 96孔板中，培養(yǎng) 12 h 后更換培養(yǎng)基，分別加入不同劑量的游離 Ce6 和 C@Hb/HSA 納米顆粒(0～1.0 μg/mL)。密封孵育 2 h 后，660 nm 激光照射 2 min (100 mW/cm2)，同時設(shè)置沒有激光處理的對照組。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，余下步驟按照CCK-8 試劑盒的說明書進行操作，最后用酶標(biāo)儀(BioTek)測定各孔在 450 nm 處的吸光度值。

2.2.6 細胞流式實驗

(1)細胞內(nèi)活性氧的檢測

首先，將 CT26.WT 細胞接種于 24 孔板(5×104個/孔)中，培養(yǎng) 12 h，使細胞充分貼壁生長。細胞的培養(yǎng)基分別替換為 RPMI-1640 培養(yǎng)基、含游離 Ce6(1.0 μg/mL Ce6)或 C@Hb/HSA(1.0 μg/mL Ce6)的培養(yǎng)基。然后，密封孵育 2 h，660 nm 激光照射 2 min (100 mW/cm2)，同時設(shè)置沒有激光照射的 C@Hb/HSA 組作對照。最后，快速加入活性氧檢測探針 DCFH-DA(20 μM)，繼續(xù)孵育 30 min 后，收集細胞并使用流式細胞分析儀(FACS CANTO II，BD)分析細胞中活性氧的產(chǎn)生情況。

(2)細胞表面鈣網(wǎng)蛋白的暴露

將 CT26.WT 細胞以 5×104個/孔的密度，接種于 24 孔板中。培養(yǎng) 12 h 后，分別更換為RPMI-1640 培養(yǎng)基、含游離 Ce6(1.0 μg/mL Ce6)或 C@Hb/HSA(1.0 μg/mL Ce6)的培養(yǎng)基，密封孵育 2 h 后，100 mW/cm2的 660 nm 激光照射2 min，同時設(shè)置沒有激光處理的 C@Hb/HSA 組作對照。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，收集細胞，先加入抗小鼠鈣網(wǎng)蛋白抗體(Anti-mouse Calreticulin)，在4℃ 避光孵育 2 h。隨后，細胞經(jīng)過洗滌后，加入 anti-rabbit-Alexa Fluor 488 抗體，孵育 1 h。最后，經(jīng)緩沖液洗滌后，采用流式細胞分析儀分析各組細胞的鈣網(wǎng)蛋白暴露水平。

(3)樹突狀細胞的體外成熟誘導(dǎo)

CT26.WT 細胞接種在 24 孔板中，細胞數(shù)為5×104個/孔。培養(yǎng) 12 h 后，分別替換為不加藥物的培養(yǎng)基、含 1.0 μg/mL Ce6 或載有 1.0 μg/mL Ce6的 C@Hb/HSA 的培養(yǎng)基，密封孵育 2 h 后，660 nm 激光處理(100 mW/cm2，2 min)細胞，同時設(shè)置沒有激光處理的 C@Hb/HSA 組作對照。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，各組細胞與分離后培養(yǎng)到第 6 天狀態(tài)良好的小鼠未成熟樹突狀細胞(5×105個/孔)共培養(yǎng)。24 h 后，收集樹突狀細胞，加入 anti-mouse MHC II-PE、anti-mouse CD86-Percp 抗體，4℃ 避光孵育 30 min。洗滌細胞后，采用流式細胞分析儀分析各組樹突狀細胞表面分子 MHC II、CD86 的表達情況。

2.2.7 統(tǒng)計分析

使用 Origin2015 軟件處理實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n＝3)表示。組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey 檢驗進行分析。其中，P＜0.001 表示有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 C@Hb/HSA 納米顆粒的表征

本文采用分子間二硫鍵共價偶聯(lián)方法將Hb 與 HSA 進行雜交結(jié)合，構(gòu)建包載 Ce6 的C@Hb/HSA 納米顆粒。C@Hb/HSA 的透射電鏡圖顯示納米顆粒呈近似球形，分散性較好(圖1(a)中的插圖)。納米顆粒的粒徑分布圖如圖 1(a)所示，通過粒度儀測得納米顆粒的平均粒徑為(25.8±5.0)nm，Zeta 電位為(－30.9±0.9)mV。由圖 1(b)紫外-可見吸收光圖譜可知，C@Hb/HSA的特征吸收峰與游離 Ce6 基本一致，僅在 662 nm處有 2 nm 的紅移，表明 Ce6 被包載后，基本保持其光學(xué)特性。為了評價 C@Hb/HSA 的攜氧能力，本文測定了其在低氧水溶液中的氧釋放曲線，結(jié)果如圖 1(c)所示。C@Hb/HSA 在 20 min內(nèi)氧氣快速釋放，隨后進入緩釋狀態(tài)；在 60 min時，溶氧濃度差達 3.3 mg/L，表明 C@Hb/HSA能夠?qū)崿F(xiàn)長期持續(xù)的供氧。

圖1 C@Hb/HSA 納米顆粒的表征Fig. 1 The characterization of C@Hb/HSA nanoparticles

3.2 C@Hb/HSA 納米顆粒的體外 PDT 效果評價

活性氧作為 PDT 中直接殺傷腫瘤細胞的關(guān)鍵物質(zhì)，其產(chǎn)生水平與 PDT 效果直接相關(guān)。因此，本文以 DCFH-DA 分子作為活性氧的檢測探針，流式定量分析各組細胞的活性氧產(chǎn)生水平(DCFH-DA 被活性氧分子氧化成具有熒光信號的DCF(二氯熒光素))。如圖 2 所示，C@Hb/HSA給藥的細胞(C@Hb/HSA(＋)組)經(jīng)激光照射后，其 DCF 的平均熒光強度分別為 Control(＋)組(光照處理無藥物)、Ce6(＋)組、C@Hb/HSA 組(無激光照射)的 2.9、2.8、3.2 倍。以上結(jié)果表明，在激光照射且較低的藥物濃度(1.0 μg/mL Ce6)下，Ce6 經(jīng)過雜交蛋白氧載體包載后，通過增氧能顯著增強其在 CT26.WT 細胞的活性氧產(chǎn)生水平。

圖2 不同處理組的細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生水平Fig. 2 Intracellular reactive oxygen species generation of different treated groups

C@Hb/HSA 在光照條件下對 CT26.WT 細胞的殺傷效果采用 CCK-8 試劑盒進行測定。由圖 3(a)可知，當(dāng) Ce6 濃度為 1.0 μg/mL 時，C@Hb/HSA(＋)組的細胞存活率僅為(17.8±5.5)%，而 Ce6(＋)組則高達(82.6±3.0)%。然而，當(dāng)沒有激光照射、C@Hb/HSA 在 Ce6 濃度小于 1.0 g/mL時，對 CT26.WT 細胞的存活率沒有影響(圖3(b))。以上結(jié)果表明，在較低的藥物濃度(Ce6為 1.0 μg/mL)下，自供氧 C@Hb/HSA 在體外水平能顯著增強 PDT 效果，且在沒激光照射時表現(xiàn)出優(yōu)良的生物相容性。

3.3 免疫原性細胞死亡標(biāo)志分子——鈣網(wǎng)蛋白的暴露

圖3 C@Hb/HSA 對 CT26.WT 細胞的 PDT 效果與生物相容性評價Fig. 3 PDT eff i cacy and biocompatibility evaluation of C@Hb/HSA in CT26.WT cells

鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，CRT)作為免疫原性細胞死亡的一種關(guān)鍵生物標(biāo)志分子。在腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡時，鈣網(wǎng)蛋白會外翻暴露于細胞的表面，產(chǎn)生“吃我”的信號，刺激抗原遞呈細胞對腫瘤細胞的識別與吞噬[16]。因此，為了探討 C@Hb/HSA 介導(dǎo) PDT 的免疫原性細胞死亡誘導(dǎo)效果，CT26.WT 細胞與C@Hb/HSA 孵育加以激光照射后，采用流式細胞儀分析鈣網(wǎng)蛋白陽性細胞比例。圖 4(a)、(b)顯示，CT26.WT 細胞在經(jīng)過 C@Hb/HSA加激光處理(C@Hb/HSA(＋)組)后，其鈣網(wǎng)蛋白陽性細胞的比例高達(72.0±15.4)%，分別為Ce6(＋)組、Control(＋)組、C@Hb/HSA 組(無激光照射)的 20.0、22.5、21.8 倍。以上結(jié)果表明，C@Hb/HSA 介導(dǎo)的 PDT 能顯著促進鈣網(wǎng)蛋白的細胞表面暴露，增強 CT26.WT 細胞的免疫原性。

3.4 樹突狀細胞的體外成熟誘導(dǎo)

樹突狀細胞作為一種重要的抗原遞呈細胞，其成熟是腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫效應(yīng)的關(guān)鍵[17]。CT26.WT 細胞與C@Hb/HSA 孵育并加以激光照射后，與未成熟的樹突狀細胞共培養(yǎng)，隨后通過流式細胞儀分析樹突狀細胞表面的 MHC II、CD86 的表達來反映樹突狀細胞的成熟情況。如圖 5(a)、(b)所示，C@Hb/HSA 加激光處理的 CT26.WT 細胞(C@Hb/HSA(＋)組)能夠誘導(dǎo)(42.5±5.1)% 的樹突狀細胞成熟，明顯高于 Ce6(＋)組的(22.5±0.7)%、Control(＋)組的(20.1±0.4)% 以及 C@Hb/HSA組(無激光照射)的(19.1±3.1)%。以上結(jié)果表明，C@Hb/HSA 介導(dǎo)的 PDT 所誘導(dǎo)的 CT26.WT細胞死亡，表現(xiàn)出較強的免疫原性，能夠在體外水平促進樹突狀細胞成熟。

4 討 論

圖4 CT26.WT 細胞經(jīng)過不同處理后的鈣網(wǎng)蛋白暴露評估Fig. 4 The assessment of calreticulin (CRT) exposure on CT26.WT cells after various treatments

近年來，Hb 類氧載體展現(xiàn)出增強腫瘤 PDT療效的潛能。Wang 等[7]利用聚合物膠束偶聯(lián)的 Hb 氧載體包裹光敏劑 ZnPc 后在細胞水平上表現(xiàn)出較強的光毒性。隨后，本文作者課題組采用聚合物(PLGA)包載光敏劑 ICG-Hb 復(fù)合物，并覆蓋磷脂層，構(gòu)建了具備穩(wěn)定供氧功能的“納米人工紅細胞”，并在動物水平上證明其能有效增強腫瘤 PDT 療效[18]。然而，磷脂、聚合物作為外源物質(zhì)且不具主動靶向性，因而聚合物偶聯(lián)或包載的納米顆粒容易被機體的肝、腎等組織清除而降低納米顆粒的腫瘤富集效率，最終影響了治療效果[19]。本研究構(gòu)建了包載光敏劑 Ce6 的雜交蛋白氧載體(C@Hb/HSA)。細胞實驗表明，Ce6 經(jīng)過雜交蛋白氧載體包載后，其體外 PDT 效果因為增氧得到了顯著的提升，展現(xiàn)了雜交蛋白氧載體的優(yōu)良供氧性能。此外，基于HSA 良好的載藥能力、生物相容性以及主動靶向性[8,20]，雜交蛋白氧載體可能具有實現(xiàn)藥物和氧氣腫瘤靶向遞送的潛力，這有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，PDT 不僅能通過活性氧直接殺傷腫瘤細胞、損傷腫瘤血管的方式消除腫瘤，而且能通過觸發(fā)免疫反應(yīng)和炎癥達到二次殺傷效果[21]，但其抗腫瘤免疫的詳細機制仍沒有完全了解。免疫原性細胞死亡概念的提出，解釋了許多癌癥療法所產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)，可為腫瘤治療提供新的依據(jù)和方向[22]。研究表明，在免疫原性細胞死亡過程中，活性氧能以刺激腫瘤細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而暴露鈣網(wǎng)蛋白的方式增加腫瘤細胞的免疫原性，引發(fā)抗腫瘤免疫響應(yīng)[16,23]。本研究發(fā)現(xiàn)，CT26.WT 細胞經(jīng)過 C@Hb/HSA 介導(dǎo)的 PDT 處理后，細胞內(nèi)的活性氧水平顯著上升，并且與后續(xù)的細胞表面鈣網(wǎng)蛋白的暴露趨勢一致。隨后的樹突狀細胞體外成熟實驗進一步證明了 C@Hb/HSA 介導(dǎo)的 PDT 能增強 CT26.WT細胞的免疫原性。這表明 C@Hb/HSA 介導(dǎo)的PDT 不僅能直接增強腫瘤細胞的殺傷，而且可能以觸發(fā)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的方式進一步殺傷腫瘤，抑制轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，后續(xù)動物實驗將進一步評價。

5 結(jié) 論

本研究以 HSA、Hb 為材料，通過二硫鍵偶聯(lián)的方法，成功構(gòu)建了具備包載光敏劑和良好供氧能力的雜交蛋白氧載體(C@Hb/HSA)。雜交蛋白氧載體能顯著提升 Ce6 分子在細胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生水平，并且在較低的藥物濃度(Ce6為 1.0 μg/mL 時)下能夠有效殺傷 CT26.WT 細胞。通過細胞表面鈣網(wǎng)蛋白的暴露實驗發(fā)現(xiàn)，C@Hb/HSA 在增強 PDT 效果的同時也能顯著增強細胞表面鈣網(wǎng)蛋白的暴露，鈣網(wǎng)蛋白陽性細胞比例高達 (72.0±15.4)%。同時，CT26.WT 細胞經(jīng) C@Hb/HSA 介導(dǎo)的 PDT 處理后，能夠在體外水平促進樹突狀細胞成熟，證明 C@Hb/HSA 介導(dǎo)的 PDT 能夠增強 CT26.WT 細胞的免疫原性。