劉學剛 劉艷彩 吳春平 李景光 趙嶺嶺 張振亞

[摘要] 目的 探究CD151對結(jié)腸癌中Wnt信號通路變化的影響。 方法 采用Western blot方法分別檢測正常結(jié)腸癌細胞（HT29）、CD151基因敲除的結(jié)腸癌細胞（CD151--HT29）中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達情況；采用實時定量PCR技術(shù)分別檢測HT29、CD151--HT29細胞中LRG-1以及LGR-5基因的表達情況；考察HT29、CD151--HT29細胞的侵襲能力。 結(jié)果 HT29細胞中存在明顯的CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白表達，而CD151--HT29細胞中并無CD151蛋白的表達，且可以觀察到LRG-1以及LGR-5蛋白表達量明顯下降；實時定量PCR結(jié)果顯示，與HT29細胞比較，CD151--HT29細胞中的LRG-1以及LGR-5基因表達顯著下降（P < 0.05）；細胞侵襲實驗可見，HT29細胞侵襲能力強于CD151--HT29細胞（P < 0.05）。 結(jié)論 CD151基因的缺失能夠抑制Wnt信號通路的起始蛋白LRG-1、LGR-5的表達，并且能夠下調(diào)癌細胞侵襲能力，提示CD151基因?qū)nt信號通路存在一定調(diào)控作用，這為結(jié)腸癌聯(lián)合靶向治療提供了一定的科學指導。

[關(guān)鍵詞] CD151；結(jié)腸癌；Wnt信號通路

[中圖分類號] R735.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0013-04

[Abstract] Objective To explore the effect of CD151 on the changes of Wnt signaling pathway in colon cancer. Methods Western blot method was used to detect colon cancer cells （HT29） and CD151 gene knockout colon cancer cells （CD151--HT29） in CD151， LRG-1 and LGR-5 protein expression； the expression of LRG-1 HT29， CD151--HT29 cells and LGR-5 gene were detected by real-time quantitative PCR technique； the invasion ability of HT29， CD151--HT29 cells was inspected. Results The results showed that there was CD151， LRG-1 and LGR-5 protein expression in HT29 cells， but no CD151 protein expression in CD151--HT29 cells， and significantly decrease could be observed in the expression of LRG-1 and LGR-5 protein； real-time quantitative PCR results showe that， compared with HT29 cells， the expression of LRG-1 and LGR-5 gene in CD151--HT29 cells decreased significantly （P < 0.05）. Cell invasion assay showed that HT29 cell invasion ability was stronger than that in CD151--HT29 cells （P < 0.05）. Conclusion The expression of CD151 gene deletion can inhibit Wnt signaling initiation protein LRG-1 and LGR-5， and decrease the cancer cell invasion， which indicates that the CD151 gene has some role in the regulation of Wnt signaling pathway， to provide some scientific guidance for the colorectal cancer combined with targeted therapy.

[Key words] CD151； Colorectal cancer； Wnt signaling pathway

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，盡管我們已經(jīng)在結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展上取得了重大突破，但是對于晚期的腫瘤轉(zhuǎn)移仍然束手無策，而腫瘤轉(zhuǎn)移恰恰正是結(jié)腸癌復發(fā)率高、治愈率低的主要原因[1-2]。眾所周知腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的、多步驟的過程，目前可以確定的是，腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤內(nèi)部的腫瘤干細胞存在密切聯(lián)系[3]，而Wnt信號轉(zhuǎn)導通路是腫瘤干細胞實現(xiàn)自我更新以及分化功能的重要信號通路[4]，其中LRG-1和LGR-5蛋白是Wnt信號轉(zhuǎn)導通路的重要參與組成，均能夠促進腫瘤血管的生成，并參與多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，CD151作為TM4SF家族中唯一的癌基因，在腫瘤血管內(nèi)皮細胞中大量表達，具有穩(wěn)定新生血管的能力[7]。為探究CD151對結(jié)腸癌中Wnt信號通路的變化影響，本研究分別比較人結(jié)腸癌細胞（HT29）、敲除CD151基因的HT29細胞（CD151--HT29）中Wnt信號轉(zhuǎn)導通路靶基因CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達情況，LRG-1和LGR-5基因轉(zhuǎn)錄情況，以及兩種細胞的侵襲能力，以期為臨床上聯(lián)合靶向治療結(jié)腸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本實驗主要涉及Western blot、實時定量PCR以及細胞侵襲四大部分實驗，主要試劑如下：DEME培養(yǎng)基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；BCA蛋白分析試劑盒（Thermo公司）；LRG-1、LGR-5、β-acting抗體（美國Abcam公司）；熒光二抗（華拓生物科技股份有限公司）；Trizol裂解液（美國invitrogen公司）；Matrigel膠（美國Becton-dickinson公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HT29、CD151--HT29放入細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，采用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)。待細胞長滿時進行細胞傳代，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基除去，使用PBS溶液清洗2～3次，再加入1 mL胰酶進行細胞消化5 min后，加入培養(yǎng)基稀釋胰酶停止消化，使用吹打管吹打培養(yǎng)基將培養(yǎng)瓶壁上的細胞吹打至培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)離心5 min后，將含有胰酶的培養(yǎng)基導入廢液缸內(nèi)，重新導入培養(yǎng)基，用吹打管將細胞吹打均勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。取正處于生長期的細胞備用。

1.2.2 Western blot技術(shù) 待細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞長滿約80%時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基倒入廢液缸內(nèi)，使用PBS溶液清洗2～3次放于冰上，加入4 mL細胞裂解液（內(nèi)含100 μL PMSF/mL），搖勻，放置在冰上裂解30 min后，用細胞刮將細胞輕輕刮下，將細胞裂解液與細胞碎片轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min離心5 min后取上清，使用BCA定量試劑盒測定上清液中所含蛋白濃度，確定并統(tǒng)一SDS-PAGE凝膠電泳上樣量。

取30 μg樣品蛋白與5倍體積的緩沖溶液混合煮沸10 min，上樣，80 V恒溫電壓跑膠3～4 h。電泳結(jié)束后交分離膠小心取下，放入置轉(zhuǎn)膜液中進行轉(zhuǎn)膜。使用ECL發(fā)光試劑盒滴加到轉(zhuǎn)好膜的PVDF膜上，作用5 min后用濾紙吸掉多余發(fā)光試劑，在暗室中根據(jù)PVDF膜的大小裁剪出適當大小的X線感光膠片進行曝光。將曝光后的膠片放入凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，使用Quantity One圖像分析軟件分析目標條帶的分子量和光密度值。

1.2.3 實時定量PCR技術(shù) 分別將處于對數(shù)生長期的HT29、CD151--HT29細胞，加入1 mL Trizol，待細胞裂解后收集至1.5 mL Ep管中，混勻，離心，取上清液置入新的Ep管內(nèi)，加入200 μL氯仿，搖勻，靜置15 min后，離心，小心取出上層水相，加入等體積的異丙醇，搖勻，可以隱約看到有白色絮狀RNA出現(xiàn)，離心，棄去上清，保留白色沉淀，將提取出來的總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA文庫。根據(jù)NCBI Gene Bank內(nèi)提供的基因序列，LRG-1和LGR-5上下游引物序列如表1所示。將引物用ddH2O溶解，配成終濃度為10 pmol/μL，于-20℃凍存，備用。各引物均取出2.0 μL，加入至PCR體系：3.0 μL cDNA，5.0 μL 5×PCR Buffer，0.5 μL MgCl2，2.0 μL上游引物，2.0 μL下游引物，12.3 μL ddH2O，總體積為25 μL，進行PCR反應。于94℃預變性4 min，94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸60 s，40個循環(huán)擴增。擴增后PCR產(chǎn)物立即進行電泳，最終用2-△△CT法計算目的基因的表達量。

1.2.4 細胞侵襲實驗 將Matrigel膠用同樣體積的不完全培養(yǎng)基稀釋后，加入至細胞小室中搖晃，使Matrigel膠平鋪在細胞小室底部，37℃成膠30 min。將準備好的細胞小室放入至24孔培養(yǎng)板中，分別在小室內(nèi)加入含有1×105個HT29、CD151--HT29細胞，再在小室外加入600 μL培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出細胞小室，棄去小室外培養(yǎng)基，使用生理鹽水以及棉簽小心擦去Matrigel膠，在倒置顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種腫瘤細胞中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達情況

采用Western blot方法分別檢測HT29、CD151--HT29細胞中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，在HT29細胞中CD151存在明顯表達，而在CD151--HT29細胞中未檢測出CD151蛋白，在HT29細胞中LRG1與參比蛋白β-actin的比值為（0.11±0.02），顯著高于CD151--HT29細胞中的LRG1與參比蛋白β-actin的比值（0.06±0.02）（t = 3.995，P = 0.016）；在HT29細胞中LGR5與參比蛋白β-actin的比值為（0.13±0.03），顯著高于CD151--HT29細胞中的LGR5與參比蛋白β-actin的比值（0.06±0.02）（t = 3.834，P = 0.019）。見圖1。

2.2 兩種腫瘤細胞中LRG-1和LGR-5基因轉(zhuǎn)錄情況

采用實時定量PCR技術(shù)分別檢測HT29和CD151--HT29細胞中LRG-1以及LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示HT29細胞中LRG-1基因的轉(zhuǎn)錄水平為（1.00±0.02），CD151--HT29細胞中LRG-1基因的轉(zhuǎn)錄水平為（0.55±0.01），HT29細胞LRG-1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CD151--HT29細胞（t = 42.375，P = 0.000）；HT29細胞中LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平為（1.00±0.02）、CD151--HT29細胞中LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平為（0.62±0.02），HT29細胞LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CD151--HT29細胞（t = 31.002，P = 0.000）。見圖2。

2.3 兩種腫瘤細胞侵襲能力

采用構(gòu)建細胞小室的方法檢測HT29、CD151--HT29細胞的侵襲能力，結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)24 h后，HT29細胞侵襲人工基底濾膜的細胞數(shù)（246.33±21.55）明顯多于CD151--HT29細胞（97.67±14.01），差異有統(tǒng)計學意義（t = 10.018，P < 0.001）。見圖3。

3 討論

近年來，隨著我國人民生活水平的提高以及飲食、環(huán)境的變化，我國結(jié)腸癌發(fā)病率正在逐年升高。傳統(tǒng)的手術(shù)治療以及化學、放射療法并不能發(fā)揮理想的治療效果，治療后仍然存在癌癥高轉(zhuǎn)移率以及高復發(fā)率，目前現(xiàn)有的科學研究水平尚不能完全解釋腫瘤轉(zhuǎn)移機制[8]。早期的研究表明，CD151能夠通過維持血管上皮細胞-細胞和細胞-基質(zhì)之間的正常黏附，從而維持新生血管的穩(wěn)定性以及通透性，是病理性血管形成的必要條件[9-10]。為了能夠更好地探究CD151調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的機制，有學者將目光轉(zhuǎn)向Wnt信號轉(zhuǎn)導通路。Wnt信號轉(zhuǎn)導通路的激活也是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件之一[11]，而CD151與Wnt信號轉(zhuǎn)導通路之間的關(guān)系尚少見報道。本研究通過比較HT29和CD151--HT29兩種細胞中Wnt信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯情況，探究CD151對Wnt信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控。

CD151是一種膜蛋白，廣泛分布于各種細胞表面，結(jié)構(gòu)上具有兩個細胞外環(huán)、兩個細胞內(nèi)末端（-COOH/-NH2）的特征，這些特征賦予了CD151能夠與細胞表面多種蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，因此CD151在眾多生理活動過程中扮演著十分重要的角色[12-13]，研究表明，CD151蛋白高表達的癌癥患者的存活率顯著低于CD151蛋白表達低的癌癥患者[14]，證明了CD151蛋白在癌癥的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要的作用。CD151主要是通過與整合素形成穩(wěn)定的復合體，調(diào)節(jié)細胞吸附以及遷移能力[15]。本研究結(jié)果顯示，CD151--HT29細胞中的LRG-1和LGR-5基因無論是轉(zhuǎn)錄階段還是在翻譯階段均受到抑制，發(fā)生下調(diào)，并且缺失CD151基因的癌癥細胞的細胞侵襲能力減弱。

LRG-1蛋白LGR-5蛋白均是Wnt信號通路的靶蛋白，其中LRG-1蛋白能夠促進腫瘤血管的生成，在正常組織中卻少有表達[16]，能夠促進腫瘤細胞的表達；LGR-5蛋白是腫瘤干細胞標志物，能夠促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，研究表明，VEGF能夠促進腫瘤血管的生成，增強腫瘤血管通透性，促進腫瘤淋巴管的生長，以及增強腫瘤細胞對放化療的耐受性，并且VEGF在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[17-18]。LGR-5主要是與Wnt信號通路的起始蛋白Wnt蛋白結(jié)合，發(fā)揮激活Wnt信號通路的作用，使得Wnt信號通路的核心蛋白β-catenin蛋白在細胞內(nèi)的積聚，當LGR-5正常表達時，β-catenin蛋白的生成與降解同時存在，β-catenin蛋白濃度維持在一個較低水平，目前多項研究表明在結(jié)腸癌細胞中β-catenin蛋白表達量顯著上升[19-20]。

綜上所述，CD151很可能是Wnt信號通路上游調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路相關(guān)基因的表達，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，這很可能會為臨床上治療結(jié)腸癌提供一個新的突破點。

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