施力光 劉誠(chéng) 彭維祺 胡海超 侯冠彧

摘 要 口蹄疫是我國(guó)規(guī)定強(qiáng)制免疫的動(dòng)物疫病。為了評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗強(qiáng)制免疫疫果，本研究采用液相阻斷ELISA法檢測(cè)了海南儋州某規(guī)模牛場(chǎng)強(qiáng)制免疫口蹄疫疫苗三價(jià)苗前后的免疫抗體水平。結(jié)果表明：強(qiáng)免口蹄疫三價(jià)滅活苗21 d后，試驗(yàn)牛血清O型、A型和亞Ⅰ型抗體效價(jià)和免疫合格率均達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)；O型和A型免疫效果優(yōu)于亞Ⅰ型免疫效果，而且肌肉注射效果優(yōu)于皮下注射效果。

關(guān)鍵詞 肉牛 ；口蹄疫 ；免疫效果 ；液相阻斷ELISA法

中圖分類號(hào) S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.020

Abstract Foot-and-mouth disease （FMD） is an animal disease provided for compulsory vaccination in China. In order to evaluate the compulsory immunity effects of FMD vaccine in beef cattle， the antibody level of the beef cattle in a beef cattle farm was monitored before and after the beef cattle was inoculated compulsorily with trivalent inactivated vaccine by using the liquid phase blocking ELISA assay in Danzhou， Hainan. The results showed that the antibody level and immunity of the beef cattle against FMD virus types O， A and Asia I were consistent with the standards required after the beef cattle were inoculated for 21 days. The immune effect of the FMD virus types O and A was better than that of the type Asia1 in the beef cattle， and the intramuscular injection had better effect than the hypodermical one.

Keywords beef cattle ； foot-and-mouth disease ； immune effects ； liquid phase blocking ELISA

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動(dòng)物的急性接觸性傳染病，具有發(fā)病快、時(shí)間短、范圍廣的流行病學(xué)特征[1]。我國(guó)將口蹄疫列為一類動(dòng)物傳染病。迄今為止，至少有7種血清型的口蹄疫病毒已被分離鑒定，包括O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型等[2]。目前預(yù)防口蹄疫病毒感染的最有效方式是通過接種疫苗，滅活的FMDV能在黏膜組織和血清中產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)，并伴隨Th1/Th2反應(yīng)[3]。農(nóng)業(yè)部下發(fā)的口蹄疫的免疫方案明確規(guī)定，對(duì)所有牛進(jìn)行O型和亞洲Ⅰ型口蹄疫的強(qiáng)制免疫。海南作為全國(guó)建成的首個(gè)“無規(guī)定動(dòng)物疫病區(qū)示范區(qū)”，根據(jù)《海南省無規(guī)定動(dòng)物疫病區(qū)管理辦法》，也對(duì)口蹄疫、高致病性禽流感、豬瘟、雞新城疫、高致病性豬藍(lán)耳病、狂犬病等6種動(dòng)物疫病實(shí)施強(qiáng)制免疫，而且免疫密度和免疫效果應(yīng)當(dāng)達(dá)到國(guó)家和海南省規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。為了評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗強(qiáng)制免疫效果，本研究對(duì)海南儋州某規(guī)模牛場(chǎng)強(qiáng)化免疫O型、A型和亞洲Ⅰ型口蹄疫疫苗三價(jià)苗后免疫抗體消長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，以期為規(guī)?；?chǎng)口蹄疫免疫提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

于海南省儋州市境內(nèi)某規(guī)模肉牛場(chǎng)隨機(jī)選取健康無病、體重相近的12～15月齡的海南黑牛（和牛×海南黃牛）40頭作為試驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分成2組，Ⅰ組和Ⅱ組，每組20頭，編號(hào)后按照常規(guī)飼養(yǎng)條件混群飼養(yǎng)。

1.1.2 強(qiáng)免疫苗

試驗(yàn)所用疫苗購(gòu)自某正規(guī)廠家生產(chǎn)的口蹄疫O型、A型、亞Ⅰ型三價(jià)滅活疫苗，接種途徑和免疫劑量按照疫苗說明書操作。

1.1.3 抗體檢測(cè)試劑

試驗(yàn)所用O型、A型、亞Ⅰ液相阻斷ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 強(qiáng)免接種

按照疫苗生產(chǎn)廠家推薦的接種劑量，所有試驗(yàn)牛于同一時(shí)間進(jìn)行強(qiáng)免接種，其中免疫試驗(yàn)Ⅰ組于頸部皮下注射3 mL，試驗(yàn)Ⅱ組于臀部肌肉注射3 mL。

1.2.2 血樣采集

試驗(yàn)過程中對(duì)30頭試驗(yàn)牛共采血5次，采血時(shí)間點(diǎn)為強(qiáng)免接種前（0 d）、強(qiáng)免后21、40、60和80 d，頸靜脈采血法用真空管采集血樣，室溫靜置15 min，待析出血清后，于4℃、2 500 r/min條件下離心15 min分離血清，用以測(cè)定抗體滴度。

1.2.3 抗體效價(jià)檢測(cè)

按照液相阻斷ELISA試劑盒操作說明提供的方法分別檢測(cè)試驗(yàn)牛血清中口蹄疫A型、O型、亞洲Ⅰ型抗體效價(jià)。根據(jù)《2017年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》規(guī)定執(zhí)行，三種口蹄疫抗體效價(jià)≥26為合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 A型口蹄疫抗體效價(jià)

試驗(yàn)牛強(qiáng)免O型、A型、亞Ⅰ型三價(jià)滅活疫苗后，A型口蹄疫抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。A型抗體強(qiáng)免前抗體滴度為1∶101，抗體合格率95%以上，試驗(yàn)?；A(chǔ)抗體水平符合國(guó)家和本省規(guī)定的免疫標(biāo)準(zhǔn)。采用肌肉注射或皮下注射強(qiáng)免后，A型抗體滴度顯著上升，免疫后21 d合格率為100，到40 d合格率也在95%以上；強(qiáng)免后60 d抗體滴度開始顯著降低，合格率也降至80%，到強(qiáng)免后90 d抗體已降至較低水平，見表1。

2.2 O型口蹄疫抗體效價(jià)

采用不同注射方法強(qiáng)免口蹄疫三價(jià)苗后O型抗體消長(zhǎng)情況如表2所示，強(qiáng)免前基礎(chǔ)抗體滴度和合格率都在較高水平。強(qiáng)免后O型抗體維持時(shí)間較長(zhǎng)，肌肉注射組試驗(yàn)牛在90 d后都能保持較高的抗體滴度和合格率。皮下注射組在免疫后60 d也能保持較高的抗體效價(jià)，90 d出現(xiàn)明顯下降，見表2。

2.3 亞Ⅰ型口蹄疫抗體效價(jià)

強(qiáng)免前，試驗(yàn)牛亞Ⅰ型抗體滴度較低，合格率也不到60%，強(qiáng)免后亞Ⅰ型抗體效價(jià)上升快，維持時(shí)間長(zhǎng)，合格率達(dá)到90 d以上。采用肌肉注射強(qiáng)免后抗體滴度略低于皮下注射后的滴度峰值，但滴度降低緩慢，能維持較長(zhǎng)時(shí)間的高抗體活性，見表3。

3 討論

按照《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012～2020年）》要求，農(nóng)業(yè)部《2017年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》明確規(guī)定，無疫區(qū)（海南）每年開展1至2次口蹄疫監(jiān)測(cè)，抗體效價(jià)≥26（1∶64）為免疫合格個(gè)體。本研究中規(guī)模牛場(chǎng)強(qiáng)免試驗(yàn)前O型、A型抗體平均滴度分別為1∶123，1∶101，免疫合格率均在90%以上，達(dá)到國(guó)家和本省規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，表明試驗(yàn)用肉牛已實(shí)施過口蹄疫大防，且免疫效果較為理想。而亞Ⅰ型抗體效價(jià)略低于O型和A型抗體（滴度為1∶83），免疫合格率僅為58%，可能原因是與大防免疫口蹄疫疫苗有關(guān)，因?yàn)樵跍缁钜呙缰?，完整FMDV粒子（146S粒子）是至關(guān)重要的免疫抗原，它的數(shù)量和穩(wěn)定性決定了疫苗的免疫效果[4-5]，亞Ⅰ型免疫特異性不強(qiáng)或者是未接種亞Ⅰ疫苗都可能造成抗體效價(jià)存在較大差異。

本研究強(qiáng)制免疫口蹄疫三價(jià)疫苗后，亞Ⅰ型抗體在免疫后21 d抗體效價(jià)顯著上升，且免疫效果持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，與李旭蓉等[6]、周靜華等[7]開展的口蹄疫免疫接種效果評(píng)價(jià)結(jié)果相似。在免后90 d仍能達(dá)到70以上的免疫合格率，表明該疫苗對(duì)亞Ⅰ型口蹄疫有較好的免疫效果，也說明海南黑牛對(duì)亞Ⅰ型口蹄疫疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)，從而使免疫抗體保持在較高的水平。李平花等[8]通過Asia1型口蹄疫病毒受體結(jié)合位點(diǎn)多樣性研究證實(shí)，含RGD受體結(jié)合位點(diǎn)為優(yōu)勢(shì)的FMDV種群，Asia1潛在的受體結(jié)合基序?qū)MDV的細(xì)胞識(shí)別和宿主嗜性的改變以及免疫效果提高起到關(guān)鍵作用。同樣，試驗(yàn)牛對(duì)O型抗體也有較理想的免疫效果，在強(qiáng)免后90 d仍能保持不低于75%的免疫合格率。邵軍軍等[9]指出，可通過增加抗原表位、引入外源載體蛋白或T細(xì)胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；楊亮等[10]通過對(duì)牛O型口蹄疫病毒Vp1蛋白上的B表位和T表位模擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證獲得理想的免疫效果。從強(qiáng)免后的試驗(yàn)結(jié)果看，A型抗體較O型和亞Ⅰ型抗體滴度都要低，與賀奮義等[11]報(bào)道的結(jié)果一致。強(qiáng)免后40 d檢測(cè)到滴度顯著上升，但抗體效價(jià)在強(qiáng)免后60 d即出現(xiàn)了較明顯的消退，表明A型口蹄疫需要再進(jìn)行二次免疫，以加強(qiáng)保護(hù)效果。

免疫程序和免疫方法對(duì)免疫效果有決定性的影響[12-13]。本研究中采用肌肉注射和皮下注射2種不同免疫接種方法，在強(qiáng)免后21 d都檢測(cè)到抗體效價(jià)達(dá)到較高水平，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，采用肌肉注射接種疫苗后的抗體水平要比皮下注射后抗體水平下降緩慢，尤其是在O型和亞Ⅰ型抗體滴度消長(zhǎng)規(guī)律中表現(xiàn)的更為明顯，而且肌肉注射接種的試驗(yàn)牛免疫合格率高于皮下注射組，這與衛(wèi)龍興等[14]在奶?？谔阋呙庖咴囼?yàn)中的結(jié)果基本一致。另外，在本研究過程中，還發(fā)現(xiàn)皮下接種后個(gè)別試驗(yàn)牛出現(xiàn)起包的現(xiàn)象，容易造成體表創(chuàng)傷化膿。韓惠瑛等[15]通過觀察肉牛免疫口蹄疫雙價(jià)苗抗體消長(zhǎng)情況，證實(shí)口蹄疫疫苗一次接種免疫抗體合格率和免疫效果均低于二次、三次免疫的效果。因?yàn)樘禺愋悦庖咧?，機(jī)體再次受到特定抗原刺激時(shí)，記憶細(xì)胞會(huì)更迅速分裂效應(yīng)T細(xì)胞和漿細(xì)胞來對(duì)抗抗原。本研究中A型口蹄疫抗體效價(jià)在強(qiáng)免后的60 d就出現(xiàn)了較大幅度衰減，如能針對(duì)性地進(jìn)行一次補(bǔ)免或強(qiáng)化免疫，抗體效價(jià)和合格率將會(huì)顯著延長(zhǎng)和提高，達(dá)到更好的免疫效果。

4 小結(jié)

綜上所述，本研究采用液相阻斷ELISA法檢測(cè)海南儋州某規(guī)模牛場(chǎng)強(qiáng)制免疫口蹄疫疫苗三價(jià)苗前后的免疫抗體水平，強(qiáng)免前該場(chǎng)肉牛O型和A型抗體水平較高，亞Ⅰ型免疫效果較差。采用不同方法統(tǒng)一強(qiáng)免后，抗體效價(jià)滴度均有明顯上升，而且肌肉注射效果優(yōu)于皮下注射效果，但不同類型抗體消長(zhǎng)規(guī)律不盡一致，針對(duì)性地在60～90 d進(jìn)行一次補(bǔ)免或強(qiáng)化免疫能達(dá)到更好的免疫效果。

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