王德杰，鄭傲

(山東電力中心醫(yī)院企業(yè)健康管理中心，濟(jì)南 250001)

衰老是中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種生理功能受損的主要因素，與進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知障礙及癡呆等疾病密切相關(guān)。炎癥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與神經(jīng)元缺失及包括阿爾茨海默病和帕金森病在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[1]。研究表明，炎癥可以增加淀粉樣蛋白的聚集最終導(dǎo)致突觸損傷，同時(shí)激活線粒體凋亡通路等[2,3]。D-半乳糖在體內(nèi)的大量聚集一方面提高氧化應(yīng)激水平，另一方面可以與蛋白質(zhì)或多肽鏈生成高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)[4]。AGEs與其受體(receptor for advanced glycation end pro-ducts，RAGE)結(jié)合參與衰老過(guò)程、炎癥、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。

黃酮類(lèi)化合物主要由苯并吡喃和苯環(huán)組成，廣泛存在于多種天然植物中，通過(guò)多種生理機(jī)制表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)功效，包括調(diào)節(jié)腦內(nèi)免疫系統(tǒng)、抑制細(xì)胞因子釋放等[6,7]。槲皮素是日常飲食中存在的主要黃酮類(lèi)化合物之一，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗血小板聚集和很強(qiáng)的抗炎、抗氧化活性，可以預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、糖尿病、癌癥、肥胖癥等多種疾病[8]。然而在退行性疾病發(fā)生之前的衰老階段，槲皮素能否延緩腦老化的研究較少。已有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過(guò)降低腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平、調(diào)節(jié)突觸內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、增加Na+-K+-ATP酶活性、增加生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43, GAP43) mRNA的表達(dá)，減輕D-半乳糖所致的神經(jīng)毒性，改善小鼠行為學(xué)損傷[9]。但對(duì)AGEs/RAGE炎癥通路的作用研究較少。本研究旨在探討槲皮素對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力以及腦內(nèi)AGEs/RAGE通路水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡雄性昆明小鼠32只，體質(zhì)量(30±4)g(山東大學(xué)動(dòng)物中心)；槲皮素、D-半乳糖(sigma公司)；兔抗AGEs、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗RAGE多克隆抗體及小鼠抗β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)多克隆抗體(Millipore公司)，蛋白印跡相關(guān)二抗(中杉金橋)，組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光液(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組(NC組)、模型組(M組)、Q1治療組(Q1組)和Q2治療組(Q2組)，每組8只。M組、Q1組、Q2組小鼠行頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/(kg·d)，NC組給予等量生理鹽水皮下注射。Q1、Q2組造模同時(shí)分別給予槲皮素5、10 mg/(kg·d)灌胃干預(yù)[10]，NC組和M組給予相同劑量生理鹽水灌胃處理，干預(yù)8周，及時(shí)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)過(guò)程中意外死亡小鼠。

1.2.2 Morris水迷宮試驗(yàn) 水迷宮設(shè)備是直徑100 cm、高60 cm的圓形水池，以2條垂直的直徑為界限將水池平分為4個(gè)象限，高約40 cm的平臺(tái)置于第一象限，水位高出平臺(tái)1 cm。定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：每天訓(xùn)練4次，訓(xùn)練5 d，將小鼠按照象限順序面向池壁沿池壁各象限邊緣中點(diǎn)放入水中，記錄小鼠入水至找到平臺(tái)并停留10 s所用時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency,EL)。若停留不足10 s，則重新入水繼續(xù)記錄時(shí)間；若小鼠60 s內(nèi)未能成功找到平臺(tái)，則協(xié)助其至平臺(tái)并停留15 s，此時(shí)EL記為60 s。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤除平臺(tái)行空間探索實(shí)驗(yàn)，于第三象限將小鼠沿池壁放入，記錄小鼠60 s內(nèi)第1次到達(dá)原平臺(tái)所在區(qū)域形成的EL、穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)及在平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間。

1.2.3 腦組織取材及總蛋白提取 腹腔注射3%苯巴比妥鈉將小鼠麻醉，斷頭取腦。稱(chēng)取腦組織100 mg，加入裂解液500 μl、蛋白酶抑制劑5 μl，制備組織勻漿，靜置30 min，4℃離心30 min，吸取上清液，-80℃保存，用于Western blotting蛋白檢測(cè)。

1.2.4 蛋白Western blotting分析 BCA法測(cè)蛋白濃度，蛋白變性后經(jīng)聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，加入AGEs、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-1β及COX-2一抗(1∶1000)4℃過(guò)夜；二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較

與NC組比較，M組小鼠到達(dá)平臺(tái)的EL明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間顯著降低(P<0.05)，提示D-半乳糖皮下注射可以導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力損害。與M組比較，Q1組小鼠在平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，Q2組小鼠EL明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，小鼠在平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間增加(P<0.05)。與Q1組比較，Q2組EL縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)增加、小鼠在平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖1)。

2.2 3組小鼠腦組織AGEs、RAGE及NF-κB表達(dá)水平比較

與NC組相比，M組小鼠AGEs、RAGE及NF-κB表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與M組相比，Q1組小鼠AGEs表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Q2組小鼠AGEs、RAGE和NF-κB表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與Q1組比較，Q2組小鼠RAGE表達(dá)顯著下降(P<0.05)，其他差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2)。

2.3 3組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β及COX-2表達(dá)水平比較

與NC組相比，M組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β和COX-2表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，提示M組腦內(nèi)炎性反應(yīng)顯著；與M組比較，Q1組和Q2組TNF-α、IL-1β和COX-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與Q1組比較，Q2組小鼠IL-1β和COX-2表達(dá)水平顯著降低，TNF-α水平在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖3)。

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)于過(guò)氧化氫、脂質(zhì)過(guò)氧化物、6-羥多巴胺、β淀粉樣肽25～35及脂多糖等多種物質(zhì)所致的神經(jīng)毒性具有較好的保護(hù)作用[11]，同時(shí)也可減輕帕金森病、癡呆、高膽固醇所致神經(jīng)病變模型動(dòng)物的腦損害[12-15]。本研究探討了槲皮素對(duì)D-半乳糖所致的衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力障礙、炎癥通路AGEs/RAGE/NF-κB的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期D-半乳糖頸背部皮下注射可以導(dǎo)致小鼠明顯的空間學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，增加腦內(nèi)AGEs及其受體RAGE的表達(dá)，誘導(dǎo)NF-κB活化及下游炎性因子表達(dá)。采用槲皮素治療能夠逆轉(zhuǎn)D-半乳糖所致的學(xué)習(xí)和記憶障礙，下調(diào)AGEs/RAGE/NF-κB通路中的炎性因子表達(dá)。

D-半乳糖是一種神經(jīng)毒物質(zhì)，可以很容易與蛋白質(zhì)和肽中氨基酸的游離胺反應(yīng)，從而誘導(dǎo)AGEs生成[16]。眾所周知，AGEs是一種有害的翻譯后蛋白修飾，可以誘導(dǎo)過(guò)量活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成及異常氧化應(yīng)激水平增高，加速衰老過(guò)程[17]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，AGEs與細(xì)胞表面受體如RAGE結(jié)合，介導(dǎo)NF-κB活化，從而最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)變性及記憶力受損[5]。因此針對(duì)AGEs/RAGE/NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的靶向藥物對(duì)于研究多種年齡相關(guān)疾病的進(jìn)展及治療方面具有很好的治療潛力。

圖1 Morris水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限滯留時(shí)間

圖2 Western blotting檢測(cè)小鼠腦內(nèi)AGEs，RAGE，NF-κB蛋白表達(dá)

已有研究表明，槲皮素具有很強(qiáng)大的抗炎能力，在多種自身免疫性小鼠模型中發(fā)揮炎癥和免疫調(diào)節(jié)活性。如槲皮素可改善角叉菜膠和高脂飲食誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低佐劑誘導(dǎo)的大鼠慢性關(guān)節(jié)炎[18]；在肥胖的Zucker大鼠中， 槲皮素可減少內(nèi)臟脂肪組織TNF-α和一氧化氮的產(chǎn)生，并下調(diào)一氧化氮合酶的表達(dá)[19]，提示槲皮素對(duì)于多種炎癥模型動(dòng)物具有較強(qiáng)的抗炎作用。對(duì)其抗炎機(jī)制的深入探討發(fā)現(xiàn)，一方面槲皮素可以通過(guò)螯合金屬離子、捕獲甲基乙二醛、捕獲ROS，從而抑制AGEs形成[20]；另一方面，槲皮素可通過(guò)直接捕獲甲基乙二醛和乙二醛，顯著抑制AGEs的形成[21]。而我們對(duì)衰老模型小鼠的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了槲皮素對(duì)AGEs的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)AGEs相關(guān)通路RAGE/NF-κB及下游炎癥因子表達(dá)水平的明顯抑制作用。

細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而加重退行性病變[1]。既往研究表明，長(zhǎng)期D-半乳糖皮下注射可增加ROS及腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，模型動(dòng)物出現(xiàn)突觸損傷、膠質(zhì)細(xì)胞激活、腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腦老化[17]。本研究采用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)到長(zhǎng)期D-半乳糖干預(yù)導(dǎo)致了小鼠記憶力受損程度，但槲皮素治療逆轉(zhuǎn)了D-半乳糖所致的學(xué)習(xí)和記憶力障礙，表現(xiàn)為小鼠EL明顯縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加、平臺(tái)象限滯留時(shí)間延長(zhǎng)，與模型組比較，劑量組炎性因子水平呈濃度依賴(lài)性減低，推測(cè)槲皮素可能通過(guò)減輕炎癥因子對(duì)腦組織的損傷而改善認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，本研究通過(guò)長(zhǎng)期皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，并采用槲皮素給予灌胃干預(yù)，發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著改善衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，下調(diào)AGEs/RAGE/NF-κB通路中炎性因子的表達(dá)。針對(duì)槲皮素對(duì)腦老化的保護(hù)作用及其機(jī)制的深入研究，可為其應(yīng)用于延緩腦衰老，預(yù)防阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變提供理論依據(jù)。