黃 娟， 任玉琴， 饒鳳琴

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 310020）

對(duì)氨基苯胂酸、硝羥苯胂酸、卡巴胂等是飼料中常用的藥物添加劑，這類添加劑的適量添加具有刺激動(dòng)物生長(zhǎng)，改善畜禽肉質(zhì)，增加飼料利用率和廣譜高效的抗菌等功效。但該類添加劑的過(guò)量添加可以使動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，促使腦病和神經(jīng)萎縮的發(fā)病率增高，而且在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程中，絕大部分含砷化合物會(huì)隨糞便排放到環(huán)境中，導(dǎo)致土壤中砷元素的蓄積污染，從而對(duì)植物尤其是農(nóng)作物產(chǎn)生毒害作用 （張樹(shù)清等，2005）。因此，飼料中砷的含量及其形態(tài)會(huì)直接影響畜禽的生長(zhǎng)和品質(zhì)，對(duì)土壤環(huán)境的安全也具有重要的影響。

目前形態(tài)分析主要的方法是色譜與檢測(cè)系統(tǒng)的聯(lián)用，包括氣相色譜-質(zhì)譜法 （GC-MS）（Roerdink等，2004）、高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法 （HPLC-AFS）（肖亞兵等，2014；賀婷婷等，2011；武鑠等，2011）和高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）法（陸奕娜等，2016；鞏佳第等，2014；倪張林等，2013）等，其中以HPLC-ICP-MS的應(yīng)用最為廣泛。HPLCICP-MS法具有檢出限低，線性范圍寬，適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品（劉崴等，2017；王松等，2016；陳邵占等，2015；楊麗君等，2011；呂超等，2010）、環(huán)境樣品（劉崴等，2015；劉鋒等，2011）中各類砷形態(tài)的檢測(cè)，許錦華（2017）利用該方法對(duì)飼料中的亞砷酸鹽As（III）、砷酸鹽As（V）、一甲基砷 （MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜堿（AsB）五種砷形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，但對(duì)飼料中常用的含砷類藥物添加劑并未涉及。本實(shí)驗(yàn)擬采用DionexIonPac AS7陰離子交換柱，建立一種有效分離檢測(cè)飼料中亞砷酸鹽As（III）、砷酸鹽As（V）、一甲基砷 （MMA）、二甲基砷（DMA）、對(duì)氨基苯胂酸 （p-ASA）、硝羥苯胂酸（ROX） 和卡巴胂 （Carbarsone）7種砷形態(tài)的HPLC-ICP-MS方法，旨在為飼料的安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ICAPQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermofisher Scientific公司；U3000型高效液相色譜儀，美國(guó)Thermofisher Scientific公司；DionexIonPac AS7陰離子交換柱（250 mm×2 mm）；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，美國(guó)BUCHI公司；渦旋儀，德國(guó)IKA公司；高壓消解罐。

超純水（電阻率 18.2 MΩ·cm），由超純水處理系統(tǒng)制備；（NH4）2CO3（分析純）、 甲醇 （分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；亞砷酸根離子[As（Ⅲ）]、砷酸根離子[As（Ⅴ）]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；硝羥苯胂酸[洛克沙胂（ROX，98%）]，阿拉丁化學(xué)試劑；對(duì)氨基苯胂酸[阿散酸（p-ASA，98%）]，西亞試劑有限公司；卡巴胂 （Carbarsone），購(gòu)于TwinbrookPRwy公司；As標(biāo)準(zhǔn)溶液，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，1000 μg/mL；Bi、Ge、In、Lu、Rh、Sc、Tb、Y 混合內(nèi)標(biāo)溶液，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，100μg/mL；ICAP Q tune B調(diào)諧液，Thermofisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件 DionexIonPac AS7陰離子交換柱 （250 mm×2 mm）；流動(dòng)相 A為 1 mmol/L（NH4）2CO3溶 液 ，B 相 為 200 mmol/L （NH4）2CO3溶液；柱溫為28℃，進(jìn)樣體積20μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.2.2 質(zhì)譜條件 入射功率 1550W，霧化器流量1.09 L/min，輔助氣流量 0.8 L/min，分析模式KED，采集時(shí)間 1200 s。采用ICAPQtune B調(diào)諧液對(duì)ICP-MS進(jìn)行優(yōu)化。由于35Cl和儀器中所用的高純氬氣易形成75ClAr+，干擾75As的測(cè)定，因此在總砷的測(cè)定中使用干擾方程75As=75M-77M（3.127）+82M（2.733）-83M（2.757）校正多原子離子的干擾，在砷形態(tài)分析中同時(shí)監(jiān)測(cè)75As、77Se、72Ge、83Kr、35Cl的信號(hào)， 用以排除35ClAr+的干擾峰（Ronkart等，2007）。

1.3 砷形態(tài)分析樣品的制備和前處理方法 本實(shí)驗(yàn)所用樣品均來(lái)自浙江省獸藥飼料監(jiān)察所抽檢樣品的留樣，取飼料樣品過(guò)60目篩待用。

稱取0.3 g（精確到0.0001 g）飼料樣品于50 mL離心管中，加入甲醇-水提取液（1∶1，V/V）10 mL，60℃水浴超聲提取2 h，取出冷卻，以8000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，向樣品殘?jiān)屑尤爰状?水提取液5 mL，60℃水浴超聲提取0.5 h，取出冷卻，以 8000 r/min離心10 min，合并上清液，此操作再重復(fù)一次。所得全部上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓蒸干，向雞心瓶中加入超純水10.00 mL，渦旋溶解，過(guò)0.45μm濾膜后，上機(jī)測(cè)定。

1.4 測(cè)定總砷含量的樣品前處理方法 稱取0.3 g（精確到0.0001 g）飼料樣品于高壓消解罐中，加入5 mL硝酸浸泡過(guò)夜。蓋好后放入恒溫干燥箱，150℃保持4 h。冷卻后取出，放在控溫電熱板上120℃趕去棕色氣體，將消化液全部轉(zhuǎn)移并定容至25 mL，用ICP-MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 實(shí)驗(yàn)選用DionexIonPac AS19和AS7兩種陰離子交換柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，采用AS19作為分析柱時(shí)，以200 mmol/L（NH4）2CO3溶液作為流動(dòng)相，以 0.45 mL/min等度洗脫，在20 min內(nèi)，ROX未能被洗脫出來(lái)，加大流速至0.6 mL/min仍不能洗脫出。選用AS7作為分析柱時(shí)，以0.45 mL/min等度洗脫，結(jié)果在20 min內(nèi)，ROX未能被洗脫出來(lái)，加大流速至0.6 mL/min，20 min內(nèi)7種化合物均能被洗脫出來(lái)，但各化合物之間不能基線分離。因此試驗(yàn)選擇AS7陰離子交換柱作為分析柱，并進(jìn)一步優(yōu)化條件。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 選用AS7作為分析柱，以200 mmol/L （NH4）2CO3溶液作為流動(dòng)相，以0.5 mL/min的流速等度洗脫，As（Ⅲ）和DMA不能完全分離，MMA、p-ASA、 As（Ⅴ）和 Carbarson也不能完全分離。為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離，嘗試采用了梯度洗脫，優(yōu)化后的洗脫程序見(jiàn)表1。在梯度洗脫的條件下，7種砷形態(tài)在20 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)完全分離，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 DionexIonPac AS7作為分析柱，流動(dòng)相優(yōu)化后7種砷形態(tài)化合物的色譜圖（10μg/L）

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化 選取生豬飼料一份 （S1），實(shí)驗(yàn)考察了甲醇+水=1+1（陳邵占等，2015）、1 mol/L H3PO4+0.1 mol/L抗壞血酸 （劉崴等，2015）、人工胃液（劉崴等，2017）、水+乙酸=19+1（陳邵占等，2017）四種體系對(duì)7種砷形態(tài)的提取效果。磷酸溶液作為提取劑，由于飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，所測(cè)樣品的基線過(guò)高，方法靈敏度低。對(duì)其他3個(gè)種類的提取劑，提取次數(shù)及提取時(shí)間進(jìn)行了正交試驗(yàn)，以提取的砷形態(tài)總和作為監(jiān)控指標(biāo)，考察最佳的提取條件，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)提取效率可以看出。提取溶劑最佳的為甲醇+水=1+1，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為60℃，為了確保含砷化合物提取完全，提取次數(shù)確定為2次。

2.3 方法的線性范圍及檢出限 分別配制1、5、10、50、100、200、300 μg/L 的 7 種砷形態(tài)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析。在上述范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。采用逐級(jí)稀釋的方法考察每種化合物的檢出限，7種化合物的檢出限（S/N=3）為0.2～0.6μg/L。若稱樣量為 0.3 g，定容至10 mL，7種砷形態(tài)在樣品中的最低檢出濃度為0.007～0.020 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.4 方法的精密度和加標(biāo)回收率 由于未能找到同時(shí)存在7種砷形態(tài)化合物的飼料樣品，因此，平行稱取6份生豬飼料（S2），向飼料樣品中加入3個(gè)質(zhì)量濃度的7種砷形態(tài)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3的方法進(jìn)行樣品的測(cè)定，同時(shí)考察方法的精密度和加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 實(shí)際樣品的分析 利用建立的方法對(duì)浙江省飼料企業(yè)生產(chǎn)的豬、雞、鴨、兔、魚和蝦飼料樣品中的砷形態(tài)進(jìn)行分析，并采用ICP-MS測(cè)定總砷，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出，所檢測(cè)的樣品中砷主要以 As（Ⅲ）、As（Ⅴ）和 DMA 的形態(tài)存在，所測(cè)樣品中無(wú)機(jī)砷的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB13078中的限量要求。生豬飼料中檢測(cè)出了高含量的ASA，砷形態(tài)色譜圖見(jiàn)圖3。HPLC/ICP-MS法檢出各含砷化合物的總量均低于ICP-MS法檢測(cè)的砷總量，說(shuō)明樣品中可能含有其他形態(tài)的含砷化合物。

表3 方法的線性范圍和檢出限

表4 方法的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)飼料中 As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA、p-ASA、ROX、Carbarsone7種砷形態(tài)化合物的分析方法。對(duì)色譜條件，樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化。采用甲醇-水溶液（1∶1，V/V）作為提取劑超聲水浴提取樣品，以DionexIonPac AS7作為分析柱，（NH4）2CO3溶液作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7種化合物在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。檢測(cè)方法的線性范圍為1～300μg/L，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.2～0.6μg/L，RSD均小于5%，加標(biāo)回收率為82.3%～104.7%。所建立的方法線性范圍寬，準(zhǔn)確度和精密度好，能夠滿足飼料中含砷化合物的測(cè)定。

表5 飼料樣品中砷形態(tài)的分析結(jié)果mg/kg

圖3 豬飼料樣品（S2）砷形態(tài)色譜圖