王 鋆

（河南省平頂山市葉縣畜牧局，河南 葉縣 467200）

對于困擾國內(nèi)哺乳動物的天花疾病，綿羊痘是導致自然死亡率最高和臨床病理狀況最嚴重的疾病[1-3]。本病主要經(jīng)呼吸道、損傷的皮膚或黏膜感染[4-6]，羊?qū)Χ徊《疽赘行暂^強，尤其是綿羊，所有綿羊無論大小羊只對痘病毒全都有易感性，羔羊免疫力低下對羊痘的抵抗力較低，羔羊感染后病死率也高，所以比成年羊易感。

羊痘根據(jù)臨床癥狀一般不難診斷，但確診還需要做實驗室檢測。必要時可取病變組織做切片，檢查感染細胞中的細胞質(zhì)包涵體，或電鏡觀察病毒顆粒；或應(yīng)用瓊脂擴散試驗，以抗綿羊痘高免血清檢查皮膚結(jié)節(jié)或結(jié)痂中的抗原。本研究根據(jù)數(shù)據(jù)庫中最新發(fā)表的綿羊痘病毒P32基因序列，設(shè)計并合成了1對能特異性擴增綿羊痘的特異性引物序列，通過分子診斷，建立了檢測與診斷綿羊痘的PCR方法。該方法可用來綿羊痘的診斷、檢測、預防控制與流行病學調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采自河南病羊的痂皮及羊血。采取痂皮0.01 g，用液氮在無菌研缽中研磨，研磨后PBS液（pH 7.0）0.5 mL，15 000 r/min離心5 min，小心取出離心管用移液槍取上清于-80℃保存。羊血清直接保存于-80℃保存。

1.2 試劑PCR擴增試劑購自大連寶生物公司；引物由上海生工合成。DNA提取試劑盒購自上海生工。

1.3 引物的設(shè)計 根據(jù)Gen Bank中P32基因序列，設(shè)計1對特異性檢測引物。P32引物為：P32F：5'-TATGGTACCTAAATTATATACGTAAATAAC-3'；P32R：5'-TCCGAGCTCTTTCCTGATTTTTCTTACTAT-3'，預期擴增片段大小為500 bp。

1.4 DNA的提取按照上海生工動物組織快速提取試劑盒說明書，按照以下步驟進行提?。孩偃?5～50 mg動物組織用液氮研磨成粉末或100 μL血清，加入500 μL裂解液裂解，65℃水浴1 h；②離心，保留上清液。③用移液槍加入等量的無水乙醇，用移液槍充分混勻，放置3～5 min，離心。④加入沖洗液離心，棄去上清。⑤用TE Buffer 50～100 μL溶解DNA，離心。

1.5 PCR擴增PCR反應(yīng)體系為50 μL體積，反應(yīng)體系中含PCR-mix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA 5 μL，H2O 16 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃10 min；95℃5 min，57℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物電泳，凝膠于紫外投射儀中觀察結(jié)果。

1.6 特異性試驗無菌提取臨床采集的羊痘陽性痂塊和血清、羊口瘡病毒疫苗的DNA，提取DNA后作為模板DNA，用上述羊痘引物進行PCR擴增并測序。

1.7 敏感性試驗以臨床采集的陽性羊痘病料提取的DAN倍比稀釋，對其敏感性進行檢測。

1.8 臨床檢測與應(yīng)用利用上述建立的檢測方法對臨床采集的病料進行檢測與鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法特異性試驗無菌提取臨床采集的羊痘陽性痂塊和血清、羊口瘡病毒疫苗的DNA，提取DNA后作為模板DNA。將羊痘病料的PCR產(chǎn)物測序，對該方法的特異性進行驗證。羊痘病毒擴增出500 bp的片段（圖1），產(chǎn)物測序和比對與羊痘同源性較高，這表明所擴增的片段為羊痘病毒，而羊口瘡病毒疫苗的DNA未擴增出條帶。

圖1 PCR特異性試驗Fig.1 PCR specificity test

2.2 敏感性試驗 以臨床采集的陽性羊痘病料提取的DAN倍比稀釋，對其敏感性進行檢測。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明PCR方法可檢出1 pg的DNA模板，具有較高的敏感性（圖2）。

圖2 PCR敏感性試驗Fig.2 PCR sensitivity test

2.3 臨床應(yīng)用 應(yīng)用上述建立的方法對10份臨床疑是樣本進行檢測，結(jié)果顯示，檢出陽性樣品6份（圖3），將陽性樣品的PCR擴增產(chǎn)物測序后比對，均為羊痘。

3 討論

圖 3 PCR羊痘試驗Fig.3 PCR sheep pox test

羊痘發(fā)病羊只主要特征為體溫升高可達41～42℃，飲食欲降低，精神萎靡，有黏液、漿液或膿性分泌物從口、鼻中流出，在全身的各個部位，主要是會陰、鼻部、口部等部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)和丘疹。致病病毒主要通過呼吸道傳染[7]，病死率也高。同時羊痘也可感染人[8-10]，因此，建立分子診斷方法是控制這種疾病的有效手段。

通常情況下，典型病例可根據(jù)臨診癥狀、病例變化和流行情況做出診斷。羊痘的確診需要進行病毒分離，分離病毒需要較長時間。同時由于病毒感染的抗體應(yīng)答水平比較低[11]，瓊脂免疫擴散試驗、血凝抑制試驗由于試驗周期長或者價格昂貴等原因限制了其應(yīng)用。本研究根據(jù)綿羊痘病毒P32基因序列，設(shè)計并合成了1對能特異性擴增綿羊痘的特異性引物序列，通過分子診斷，建立了檢測與診斷綿羊痘的的分子診斷方法，該方法可用來綿羊痘的診斷與流行病學調(diào)查。