鄭亞光 齊敬宇 張博綦 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

高產(chǎn)奶牛尤其是泌乳高峰期的奶牛，由于較高的營(yíng)養(yǎng)需求和代謝水平，通常伴隨著自由基類代謝產(chǎn)物的增加。過(guò)量的自由基可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，造成機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力、免疫功能及炎癥應(yīng)答能力下降，使奶牛對(duì)疾病的易感性增強(qiáng)。研究表明，從妊娠后期到圍產(chǎn)期和泌乳高峰期，奶牛氧化應(yīng)激水平的進(jìn)程性提高是導(dǎo)致免疫功能障礙的主要原因[1-2]。因此，深入探討奶牛機(jī)體的氧化應(yīng)激發(fā)生機(jī)制、減緩氧化應(yīng)激的發(fā)生、提高其免疫功能對(duì)保障奶牛的健康生產(chǎn)具有重要的理論與實(shí)際意義。一氧化氮(NO)是生物體內(nèi)的一種氣體信號(hào)分子和活性氮自由基，存在于多種細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)中，主要具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)信號(hào)傳遞、血壓生理調(diào)控和血小板凝聚抑制等生理功能[3]。研究證實(shí)，NO的濃度與機(jī)體多種信號(hào)通路的活性和炎癥反應(yīng)有關(guān)，低劑量的NO對(duì)維持機(jī)體免疫功能、血流量、血小板凝集反應(yīng)和神經(jīng)傳遞等內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的生理作用，而過(guò)多的NO通常伴隨有炎癥和免疫紊亂。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在生理情況下不表達(dá)，而在炎癥狀態(tài)下iNOS被激活產(chǎn)生大量NO，導(dǎo)致組織損傷，加劇炎癥進(jìn)程[4]，由此得出，NO的過(guò)量產(chǎn)生可能是引起奶牛氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因之一。本課題組的前期研究表明，高劑量二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)使奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并已成功建立NO誘導(dǎo)的BMEC氧化損傷模型[5]。奶牛外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠反映機(jī)體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應(yīng)激能力與奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相關(guān)。目前，關(guān)于PBMC氧化應(yīng)激發(fā)生機(jī)制的研究報(bào)道較少。有研究認(rèn)為，分布于巨噬細(xì)胞的iNOS在機(jī)體的免疫應(yīng)答后激活并產(chǎn)生過(guò)量的NO，是引起PBMC氧化應(yīng)激和機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇的原因之一[6]。鑒于此，本研究以DETA/NO為NO供體，篩選NO的作用濃度與作用時(shí)間，建立奶牛體外PBMC的NO損傷模型，為通過(guò)體外法揭示奶牛PBMC的氧化應(yīng)激機(jī)制，進(jìn)一步緩解高產(chǎn)奶牛氧化應(yīng)激提供基礎(chǔ)性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PBMC，采用單次密度梯度離心分離法分離培養(yǎng)制備；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；臺(tái)盼藍(lán)、牛PBMC分離液，購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DETA/NO，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.2 DETA/NO培養(yǎng)液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg DETA/NO溶于612.8 μL的超純水中，配制成濃度為0.1 mol/L的母液，配制方法參照本課題組前期試驗(yàn)[5]。再將DETA/NO母液按試驗(yàn)要求配制成不同濃度(0、50、100、200、300、500 μmol/L)的DETA/NO貯備液。取不同濃度的DETA/NO貯備液加入到RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配制成DETA/NO終濃度分別為0、50、100、200、300、500 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液。各細(xì)胞培養(yǎng)液中除DETA/NO濃度不同外，其他成分均相同。將上述細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。

1.3 PBMC的培養(yǎng)

本試驗(yàn)利用單次密度梯度離心分離法分離培養(yǎng)PBMC，分離培養(yǎng)方法參照天津?yàn)骉BD牛PBMC分離液說(shuō)明書。健康奶牛尾靜脈采血后，12 h內(nèi)進(jìn)行PBMC分離。將血液樣本用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋1倍后，小心地將血液加于牛PBMC分離液上方，15 mL離心管中稀釋后血液與分離液比例為1∶1，400～500×g分離40 min(離心機(jī)溫度低于25 ℃,細(xì)胞獲得率高低與室溫有關(guān)，超過(guò)25 ℃時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率)，離心后由上至下分為4層，第1層為血漿層，第2層為環(huán)狀乳白色PBMC層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細(xì)胞層。吸取第2層，并用PBS重懸清洗細(xì)胞，250×g離心10 min后棄上清，重復(fù)清洗細(xì)胞2次后，將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)68 h后將細(xì)胞離心后收集進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h取部分細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(>95%)

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為2個(gè)部分。試驗(yàn)1采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將細(xì)胞離心后重懸于不同濃度的DETA/NO培養(yǎng)液中，以6×106個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，并隨機(jī)分為30個(gè)組，每組8個(gè)重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)液中DETA/NO的終濃度分別為0、50、100、200、300、500 μmol/L，并在37 ℃下分別作用2、4、6、8、12 h，通過(guò)測(cè)定其對(duì)細(xì)胞存活率的影響，初步篩選DETA/NO適宜的作用時(shí)間，其中以0 μmol/L為對(duì)照組。試驗(yàn)2采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)后得到的PBMC以6×106個(gè)/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，并隨機(jī)分為6個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)液中DETA/NO的終濃度分別為0、50、100、200、300、500 μmol/L，在37 ℃下以試驗(yàn)1篩選得出的DETA/NO適宜作用時(shí)間為DETA/NO的處理時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液抗氧化指標(biāo)和炎癥因子，進(jìn)一步篩選出DETA/NO的適宜作用濃度，其中以0 μmol/L為對(duì)照組。

1.5 樣品采集與處理

將24孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液以重復(fù)為單位，分別收集于1.5 mL Eppendorf離心管中，于4 ℃、10 000×g離心 5 min，收集上清液用于抗氧化指標(biāo)與炎癥因子的測(cè)定，樣品采集與處理方法參照本課題組前期相關(guān)試驗(yàn)[7]。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 細(xì)胞存活率

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，以吸光度值反映細(xì)胞的數(shù)量[8]。按照試驗(yàn)1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)將細(xì)胞懸液以6×106個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL的細(xì)胞懸液加入CCK-8的體積為10 μL，避光37 ℃孵育4 h后在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值(OD450 nm)，各組的細(xì)胞存活率用相對(duì)于對(duì)照組OD450 nm的百分比表示。對(duì)照組的細(xì)胞存活率表示為100%。

細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組OD450 nm- 空白組OD450 nm)/

(對(duì)照組OD450 nm-空白組OD450 nm)×100。

1.6.2 抗氧化指標(biāo)與炎癥因子

抗氧化指標(biāo)：超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測(cè)定，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

炎癥因子：NO、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量均采用雙抗體夾心法測(cè)定，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DETA/NO作用濃度與作用時(shí)間對(duì)PBMC存活率的影響

由表1可以看出，與對(duì)照組相比，作用時(shí)間為4～12 h時(shí)，所有作用濃度的DETA/NO對(duì)PBMC存活率均具有顯著的降低作用(P<0.05)，且隨著DETA/NO作用濃度的增加，PBMC存活率呈逐漸的降低趨勢(shì)。作用時(shí)間為4 h時(shí)，DETA/NO作用濃度為50、100 μmol/L時(shí)，PBMC存活率組間差異不顯著(P>0.05)，但數(shù)值上有下降的趨勢(shì)；DETA/NO作用濃度為200～500 μmol/L時(shí)，PBMC存活率隨作用濃度的增加顯著下降(P<0.05)；作用濃度為300、500 μmol/L時(shí)PBMC存活率分別為59.3%和47.7%，顯著低于作用濃度為50、100和200 μmol/L時(shí)(P<0.05)，作用濃度為50、100和200 μmol/L時(shí)PBMC存活率均在70%以上。作用時(shí)間為6、8 h的各濃度組中，100～500 μmol/L組作用6 h時(shí)PBMC存活率為30.9%～54.1%，作用8 h時(shí)PBMC存活率為22.1%～52.6%，均顯著低于對(duì)照組和50 μmol/L組(P<0.05)；作用時(shí)間為12 h的各濃度組中，100～500 μmol/L組PBMC存活率為22.5%～50.4%，顯著低于對(duì)照組和50 μmol/L組(P<0.05)。當(dāng)DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時(shí)，作用時(shí)間分別為2、4、6 h時(shí)，PBMC存活率均在80%以上，當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至8、12 h時(shí)，PBMC存活率降低，分別為76.8%、75.8%。當(dāng)DETA/NO作用濃度分別為300、500 μmol/L時(shí)，隨著DETA/NO作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PBMC存活率分別由2 h的83.7%、79.5%均降低至60%以下，最低降到22.1%。

2.2 DETA/NO作用濃度對(duì)PBMC抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的影響

由表2可以看出，不同濃度的DETA/NO作用4 h后，SOD活性隨著DETA/NO作用濃度的增加呈下降趨勢(shì)。當(dāng)DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時(shí)，SOD活性相比對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)DETA/NO濃度為100～500 μmol/L時(shí)，SOD活性相比對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，且DETA/NO作用濃度為200～500 μmol/L時(shí)的SOD活性還顯著低于DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時(shí)(P<0.05)，尤以作用濃度為500 μmol/L時(shí)SOD活性最低。GPx和CAT活性呈現(xiàn)與SOD活性相似的變化規(guī)律，MDA含量則呈現(xiàn)與SOD活性相反的變化規(guī)律，且以作用濃度為DETA/NO 500 μmol/L時(shí)GPx和CAT活性最低，MDA含量最高。

由表3結(jié)果可以看出，不同濃度的DETA/NO作用4 h后，隨著DETA/NO作用濃度的增加TNF-α含量逐漸升高，以500 μmol/L組TNF-α含量最高；DETA/NO作用濃度為50～500 μmol/L時(shí)的TNF-α含量相較對(duì)照組均顯著上升(P<0.05)。NO、IL-1、IL-6含量與TNF-α含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，但DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時(shí)IL-1含量與對(duì)照組相比在數(shù)值上呈上升趨勢(shì)，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表1 DETA/NO作用濃度與作用時(shí)間對(duì)PBMC存活率的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 DETA/NO作用濃度對(duì)PBMC抗氧化指標(biāo)的影響

表3 DETA/NO作用濃度對(duì)PBMC炎癥因子含量的影響

3 討 論

NO是生物體內(nèi)的一種氣體信號(hào)分子和活性氮自由基，介導(dǎo)多種生物功能，如宿主防御、血管舒張等[9]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸轉(zhuǎn)化過(guò)程中生成的，并通過(guò)一氧化氮合酶(NOS)內(nèi)源合成。巨噬細(xì)胞來(lái)源的NO在生理、病理和炎癥反應(yīng)中起重要作用，然而NO的過(guò)量產(chǎn)生引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激[10]。DETA/NO是人工合成的NO/核苷化合物，無(wú)需酶催化便能迅速釋放NO且半衰期長(zhǎng)，有利于體外試驗(yàn)的長(zhǎng)時(shí)程觀察，是較為理想的外源性NO供體[11]。因此，以DETA/NO為NO供體，誘導(dǎo)PBMC建立氧化損傷模型，可為科學(xué)調(diào)控奶?？寡趸芰皺C(jī)制研究提供理想的試驗(yàn)平臺(tái)。

周麗娜等[12]的研究指出，細(xì)胞死亡率為20%～30%可以作為建立小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。Huo等[13]報(bào)道，在小鼠的心肌細(xì)胞中，選取細(xì)胞存活率為40%～50%作為過(guò)氧化氫(H2O2)氧化損傷模型的依據(jù)。孫婧陶等[14]指出，以細(xì)胞死亡率為50%～60%作為建立延邊奶山羊BMEC氧化損傷模型的判別標(biāo)準(zhǔn)。葉新平等[15]在人的體外淋巴細(xì)胞損傷試驗(yàn)中，使用低濃度乙醇建立了氧化損傷模型，將乙醇對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制率控制在10%。郭詠梅等[5]在用DETA/NO建立BMEC損傷模型時(shí)，將細(xì)胞死亡率控制在20%～30%作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)上述研究報(bào)道可知，由于細(xì)胞種類及使用的刺激源不同，細(xì)胞對(duì)氧化損傷的耐受能力也不相同，在選擇細(xì)胞損傷標(biāo)準(zhǔn)上也存在差異。

本試驗(yàn)初步確定將細(xì)胞死亡率控制在20%～30%作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，當(dāng)DETA/NO作用4 h后，50、100 μmol/L組的PBMC存活率分別為89.9%和87.2%，而200 μmol/L組的PBMC存活率表現(xiàn)出顯著下降，為72.3%。在全部濃度組中以細(xì)胞存活率控制在70%～80%內(nèi)的DETA/NO作用濃度與作用時(shí)間可供參考的是：50 μmol/L作用8或12 h，PBMC存活率分別為76.8%和75.8%；200 μmol/L作用 4 h，PBMC存活率為72.3%；500 μmol/L作用2 h，PBMC存活率為79.5%。

DETA/NO作用時(shí)間為2 h時(shí)，各濃度組的PBMC存活率隨著作用濃度的增加在數(shù)值上有下降的趨勢(shì)，除500 μmol/L組PBMC存活率為79.5%外，其余各組PBMC存活率均在80%～90%之間，表現(xiàn)為細(xì)胞在不同濃度的DETA/NO處理下仍保持較好的生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞活力，即PBMC對(duì)DETA/NO的氧化損傷具有較好的耐受性；但考慮到作用濃度過(guò)高不適合作為DETA/NO損傷的適宜作用濃度。另外，當(dāng)DETA/NO作用時(shí)間為12 h時(shí)，盡管50 μmol/L組PBMC存活率為75.8%，但作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不便于試驗(yàn)進(jìn)行。200 μmol/L DETA/NO作用4 h，可使PBMC存活率降低至72.3%，綜合作用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)、作用濃度不宜過(guò)高，初步篩選DETA/NO作用4 h即可使PBMC的氧化應(yīng)激達(dá)到較為理想的損傷效果，便于后續(xù)試驗(yàn)繼續(xù)對(duì)DETA/NO的作用濃度進(jìn)行合理篩選。

活性氧物質(zhì)的生物效應(yīng)在體內(nèi)受到多種酶和非酶防御機(jī)制的控制，SOD、CAT、GPx活性及MDA含量可反映出細(xì)胞是否受到氧化損傷以及細(xì)胞的氧化損傷程度[16]。NO、IL-1、IL-6、TNF-α是當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激后產(chǎn)生的常見(jiàn)的炎癥因子，測(cè)定這些炎癥因子含量可以進(jìn)一步反映細(xì)胞氧化損傷的程度[17]。因此，細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立，除了以細(xì)胞存活率作為判別指標(biāo)外，細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)和炎癥因子含量的變化也是非常關(guān)鍵的判別指標(biāo)。通過(guò)本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，與對(duì)照組相比，當(dāng)DETA/NO作用時(shí)間為4 h、作用濃度為100～500 μmol/L時(shí)，即可引起SOD、CAT、GPx活性顯著下降，MDA含量顯著升高；當(dāng)DETA/NO作用時(shí)間為4 h、作用濃度為50 μmol/L時(shí)，即可引起NO、IL-6、TNF-α含量顯著上升。如前所述，引起PBMC存活率達(dá)到70%～80%的DETA/NO作用濃度為200 μmol/L、作用時(shí)間為4 h，因此，結(jié)合以上抗氧化指標(biāo)與炎性因子的結(jié)果可以得出，以DETA/NO為外源刺激源作用于PBMC時(shí)，當(dāng)其作用濃度為200 μmol/L、作用時(shí)間為4 h時(shí)，即可引起PBMC的氧化應(yīng)激損傷和抗氧化能力降低，并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

以DETA/NO為刺激源，其在37 ℃下誘導(dǎo)PBMC建立PBMC氧化損傷模型的適宜作用濃度和作用時(shí)間分別為200 μmol/L和4 h。