習(xí)丙文 陸春云 任鳴春 米海峰 謝 駿*

(1. 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，無(wú)錫214081； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，無(wú)錫214081；3. 通威股份有限公司, 成都610000)

黏蛋白(mucin)是黏液的重要組成部分，主要由胃腸道、呼吸道和尿道等器官黏膜組織的杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞所分泌，是動(dòng)物機(jī)體抵御外部病原菌入侵的重要物理屏障[1-2]。在自然界，動(dòng)物與微生物普遍共生，動(dòng)物機(jī)體分泌的黏蛋白對(duì)自身防御病原感染具有重要作用[3]。目前相關(guān)的報(bào)道主要集中在哺乳類和禽類，而魚(yú)類黏蛋白的研究則較少。大多數(shù)魚(yú)類黏蛋白研究主要針對(duì)黏液中溶菌酶、免疫球蛋白、抗菌多肽等成分[4]。相較于陸生動(dòng)物，魚(yú)類與水環(huán)境中的微生物存在緊密共生關(guān)系，為阻擋病原菌的侵襲，魚(yú)類在體腸道、表皮、鰓等組織器官上皮覆蓋著一層黏液[5]。近年來(lái)關(guān)于陸生動(dòng)物黏蛋白的研究表明，飼糧中碳水化合物的含量對(duì)動(dòng)物腸道黏蛋白的分泌有影響；饑餓處理會(huì)改變黏蛋白在動(dòng)物小腸內(nèi)的分布，進(jìn)而可能影響動(dòng)物腸道消化和機(jī)體免疫[6-7]。

團(tuán)頭魴是重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種，以湖北、江蘇等地養(yǎng)殖產(chǎn)量最高。在一些高密度養(yǎng)殖地區(qū)零星發(fā)生的黏液減少、細(xì)菌性出血等疾病嚴(yán)重阻礙該品種的健康養(yǎng)殖發(fā)展[8-9]。團(tuán)頭魴在養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)體表黏液減少的問(wèn)題，可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境(pH、氨氮或硝酸鹽)脅迫或者是營(yíng)養(yǎng)或苗種原因造成的。但目前關(guān)于魚(yú)類黏液分泌調(diào)控研究相對(duì)缺乏，團(tuán)頭魴體表黏液減少的原因仍然需要不斷探討。本試驗(yàn)以團(tuán)頭魴幼魚(yú)為研究對(duì)象，分析飼料不同脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)免疫力和腸道黏蛋白2(Muc2)和表皮黏蛋白5b(Muc5b)基因表達(dá)的影響，以期為團(tuán)頭魴養(yǎng)殖中的疾病防控提供基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用團(tuán)頭魴幼魚(yú)來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院南泉實(shí)驗(yàn)基地，暫養(yǎng)在池塘網(wǎng)箱中。7 d后，選取540尾活力強(qiáng)、個(gè)體規(guī)格均勻、初始體重為(10.0±0.5) g的團(tuán)頭魴幼魚(yú)，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)(網(wǎng)箱)30尾魚(yú)，分別投喂脂肪水平為2.29%、4.29%、6.29%、8.29%、10.29%、12.29%的等氮等能試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼料提供 The premix provided the following per kg of diets: Cu (as CuSO4·5H2O) 2.5 g，F(xiàn)e (as FeSO4·7H2O) 28 g，Zn (as ZnSO4·7H2O) 22 g，Mn (as MnSO4·4H2O) 9 g，Na (as Na2SeO3) 0.045 g，K (as KI) 0.026 g，Co (as CoCl2·6H2O) 0.1 g，VA 900 000 IU，VD 250 000 IU，VC 5 000 mg，VK3220 mg，VB1320 mg，VB21 090 mg，VB65 000 mg，VB12116 mg，生物素 biotin 50 mg，泛酸鹽 pantothenate 1 000 mg，葉酸 folic acid 165 mg，膽堿 choline 60 000 mg，肌醇 inositol 15 000 mg，煙酸 niacin acid 2 500 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖池塘水深約2.5 m，養(yǎng)殖網(wǎng)箱規(guī)格為2.0 m×1.0 m×1.5 m。試驗(yàn)開(kāi)始后，每天定時(shí)定點(diǎn)投喂4次，日投喂量為魚(yú)體重的3%～5%，具體投喂量根據(jù)魚(yú)攝食和天氣情況作適當(dāng)調(diào)整，每次投喂以魚(yú)不剩殘料為準(zhǔn)。養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，池塘水溫為25.5～30.0 ℃，pH為7.1～7.6，氨氮含量<0.1 mg/L，溶氧含量>5 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.06 mg/L。整個(gè)養(yǎng)殖試驗(yàn)8周。

1.3 樣品的采集與處理

養(yǎng)殖結(jié)束后禁食24 h，撈取各網(wǎng)箱試驗(yàn)魚(yú)，用MS-222(150 mg/L, Sigma)麻醉，記錄魚(yú)的數(shù)量和重量。從各網(wǎng)箱隨機(jī)選取4尾魚(yú)，用一次性注射器尾靜脈采血，測(cè)量體長(zhǎng)、體重，迅速將魚(yú)在冰盤(pán)上解剖，分離內(nèi)臟和肝臟稱重；剪取0.1 g肝臟浸入1 mL RNAiso Plus(TaKaRa)的離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?；將剩余肝臟裝入自封袋，-20 ℃保存?zhèn)溆?；剪取腸道和表皮組織浸入1 mL RNAiso Plus中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。血液離心(4 ℃，10 000 r/min，5 min)后，血清-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

血清皮質(zhì)醇(cortisol)含量采用MAGLUMI1000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行測(cè)定。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性均在邁瑞B(yǎng)S-400全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)所用試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物有限公司。

1.3.2 肝臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

肝臟樣品解凍后用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重；取適量肝臟按1∶9的比例勻漿。將勻漿液離心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)，取上清液-70 ℃保存?zhèn)溆?。肝臟丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均采用試劑盒測(cè)定。檢測(cè)所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 總RNA提取和cDNA制備

樣品(<0.1 g)用高通量組織破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)充分勻漿后，取上清樣品?？俁NA提取嚴(yán)格參照RNAiso Plus使用步驟。獲得的RNA用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)檢測(cè)質(zhì)量及濃度，選取OD260/280值在1.8～2.0的樣品，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)去除殘留基因組DNA，并用50 ng/μL的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

基因表達(dá)分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法，所用引物見(jiàn)表2，內(nèi)參基因選用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)[10]。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。qRT-PCR反應(yīng)試劑采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)，在ABI PRISM 7500 Real-time PCR System儀器上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)程序參數(shù)設(shè)置參照薛春雨等[5]。陰性對(duì)照以滅菌雙蒸水代替cDNA模板；每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。通過(guò)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量基因表達(dá)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

1.4 攻毒試驗(yàn)

采樣后剩余的團(tuán)頭魴幼魚(yú)繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，各組隨機(jī)選取30尾，用本實(shí)驗(yàn)室分離保存的致病嗜水氣單胞菌株進(jìn)行腹腔注射攻毒[11]。每尾魚(yú)注射0.1 mL菌液(細(xì)菌濃度107CFU/mL)，觀察并記錄攻毒14 d內(nèi)魚(yú)的死亡情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié) 果

2.1 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

如表3所示，6.29%和8.29%組增重率(WGR)顯著高于其他各組(P<0.05)，8.29%組肥滿度(CF)顯著高于其他各組(P<0.05)，6.29%和8.29%組飼料系數(shù)(FCR)顯著低于其他各組(P<0.05)，8.29%組肝體比(HSI)顯著高于10.29%組(P<0.05)；各組間存活率、臟體比(VSI)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values with different letter superscripts in the same row mean significantly different (P<0.05). The same as below.

2.2 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

如表4所示，血清皮質(zhì)醇含量及ALT和AST活性隨著飼料脂肪水平的升高呈逐漸上升的趨勢(shì)。12.29%組血清皮質(zhì)醇含量及ALT和AST活性最高，顯著高于2.29%、4.29%、6.29%和8.29%組(P<0.05)，但與10.29%組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

2.3 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表5所示，隨著飼料中脂肪水平從2.29%升高到8.29%，魚(yú)體肝臟中SOD、CAT活性和GSH含量呈上升趨勢(shì)，8.29%組顯著高于2.29%組(P<0.05)；而GR活性在6.29%組最高，除8.29%組外，顯著高于其他各組(P<0.05)；MDA含量則隨著飼料中脂肪水平上升呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，在6.29%組含量最低，顯著低于2.29%和12.29%組(P<0.05)。

2.4 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)Muc2、Muc5b基因表達(dá)的影響

如圖1和圖2所示，隨著飼料中脂肪水平的增加，腸道Muc2與表皮Muc5b基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；其中，Muc2基因的最高表達(dá)量出現(xiàn)在12.29%組，顯著高于其他各組(P<0.05)；Muc5b基因表達(dá)量在8.29%組最高，與12.29%組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。

表5 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

柱狀圖標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Bars with different letters mean significantly different (P<0.05). The same as below.

圖1飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)腸道Muc2基因表達(dá)的影響

Fig.1 Effects of dietary lipid level on intestinalMuc2 gene expression of juvenile blunt snout bream (Megalobramaamblycephala)

2.5 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)感染嗜水氣單胞菌后死亡率的影響

如圖3所示，2.29%和12.29%組死亡率較高，6.29%和8.29%組死亡率較低，且顯著低于除4.29%組外的其他各組(P<0.05)。

3 討 論

飼料脂肪水平對(duì)養(yǎng)殖水生動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖都有顯著影響；在魚(yú)體的不同生長(zhǎng)階段和生活季節(jié)對(duì)飼料脂肪的需求都存在顯著差異。該研究對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)進(jìn)行為期8周的投喂研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期投喂飼料脂肪水平為6.29%～8.29%的團(tuán)頭魴幼魚(yú)生長(zhǎng)的更好，飼喂該脂肪水平飼料的團(tuán)頭魴幼魚(yú)在受到嗜水氣單胞菌感染后的死亡率也最低，這與蔣陽(yáng)陽(yáng)等[12]的研究結(jié)果相一致。筆者在養(yǎng)殖調(diào)研中也發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴養(yǎng)殖的商品飼料中脂肪水平多數(shù)控制在7%左右。

圖2 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)表皮 Muc5b基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of dietary lipid level on skin Muc5b gene expression of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala)

養(yǎng)殖過(guò)程中魚(yú)體應(yīng)激嚴(yán)重影響魚(yú)的生長(zhǎng)、健康和疾病的發(fā)生。皮質(zhì)醇和兒茶酚胺激素含量是動(dòng)物重要的應(yīng)激指標(biāo)[13]。機(jī)體皮質(zhì)醇和兒茶酚胺含量的升高會(huì)引起血壓和血糖含量升高，糖原降解等，短期應(yīng)激對(duì)免疫有促進(jìn)作用，長(zhǎng)期應(yīng)激造成機(jī)體免疫抑制作用[14]。養(yǎng)殖過(guò)程中不合適的放養(yǎng)密度、溶解氧含量、水質(zhì)等因素都對(duì)養(yǎng)殖水生動(dòng)物造成嚴(yán)重應(yīng)激[15-16]。飼料營(yíng)養(yǎng)不能滿足養(yǎng)殖魚(yú)類需求也會(huì)造成應(yīng)激。Vielma等[17]研究表明，長(zhǎng)期投喂過(guò)高碳水化合物的飼料不利于歐洲鮭(Coregonuslavaretus)生長(zhǎng)；任鳴春等[18]研究表明，投喂淀粉水平超過(guò)36.3%的飼料對(duì)團(tuán)頭魴的生長(zhǎng)和抗應(yīng)激有抑制作用。

圖3 飼料脂肪水平對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)感染嗜水氣單胞菌后死亡率的影響Fig.3 Effects of dietary lipid level on death rate of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) after challenged with Aeromonas hydrophila

該試驗(yàn)結(jié)果表明，血清皮質(zhì)醇含量隨著飼料中脂肪水平的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，并在脂肪水平為12.29%時(shí)達(dá)到最高。ALT和AST是魚(yú)體血液中2個(gè)重要的轉(zhuǎn)氨酶。ALT活性增加，表示肌肉組織或者心臟發(fā)生功能障礙，而AST活性增加，則表示肝臟出現(xiàn)功能障礙[19]。該試驗(yàn)結(jié)果顯示魚(yú)體血清ALT和AST的活性均隨著飼料中脂肪水平的增加而上升。在羅非魚(yú)的研究中也呈現(xiàn)出一致的結(jié)果[20]。較低或較高飼料脂肪水平都會(huì)引起魚(yú)體抗病力下降，病原感染死亡率升高。

Muc2主要分布在動(dòng)物腸道，在腸道營(yíng)養(yǎng)吸收和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[21-25]。研究表明飼料中添加β-葡聚糖可以有效提高雞和豬腸道中Muc2基因的表達(dá)量[26-27]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著飼料脂肪水平的增加，腸道Muc2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，表明高脂肪水平可以提高團(tuán)頭魴幼魚(yú)腸道Muc2基因的表達(dá)。盡管腸道黏蛋白分泌增加的具體作用不是很清楚，但腸道增厚的黏液層必將影響營(yíng)養(yǎng)吸收。因此，投喂高脂肪水平的飼料引起的腸道Muc2基因表達(dá)量上調(diào)，可能是魚(yú)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收的自我調(diào)控。

魚(yú)體表皮黏液在調(diào)節(jié)滲透壓、抵御病原侵襲等方面發(fā)揮重要作用[28-32]。表皮黏液成分非常復(fù)雜,包含有黏蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、凝集素等，其中Muc5b是最主要的骨架成分[5]。因此，Muc5b基因表達(dá)量的高低影響著魚(yú)體表黏液的多少。該研究結(jié)果表明，隨著飼料脂肪水平的升高，團(tuán)頭魴幼魚(yú)表皮Muc5b基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，8.29%試驗(yàn)組表達(dá)量最高。飼料中過(guò)低和過(guò)高的脂肪水平都會(huì)降低體表黏蛋白的表達(dá)。

團(tuán)頭魴幼魚(yú)階段最適飼料脂肪水平6.29%～8.29%,這與養(yǎng)殖生產(chǎn)中團(tuán)頭魴商品飼料的脂肪水平相近。因此，商品飼料脂肪水平可能不是引起團(tuán)頭魴體表黏液減少的主要原因。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼料脂肪水平在6.29%～8.29%時(shí)，團(tuán)頭魴幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、抗病力和表皮Muc5b基因表達(dá)量最高。