閆 研 于 伽 王鈞藝 嚴(yán)昌國(guó) 李香子

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延邊黃牛肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，延吉133000 )

近年來(lái)，隨著生活品質(zhì)的提高，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注畜產(chǎn)品安全與健康。脂肪酸對(duì)人類健康的影響一直受到廣泛關(guān)注，牛肉脂肪組織中一些脂肪酸如油酸和共軛亞油酸(CLA)的異構(gòu)體[1]對(duì)機(jī)體健康很有益處，這使得牛肉深受人們喜愛(ài)。肉牛脂肪組織中的脂肪酸組成是影響肉品質(zhì)的重要指標(biāo)[2]。研究表明，對(duì)飼糧中脂肪含量的調(diào)整可增加牛肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改變脂肪酸組成，從而更有益于機(jī)體的健康[3]。Petri等[4]通過(guò)飼喂富含亞油酸或亞麻酸的植物油或油料種子增加反芻動(dòng)物脂肪代謝中產(chǎn)生的油酸和CLA；林鳳英等[5]在飼糧中添加富含不飽和脂肪酸(UFA)，尤其是單不飽和脂肪酸(MUFA)的全脂油籽改變了反芻動(dòng)物體組織中脂肪酸組成，并通過(guò)種皮的特性來(lái)影響瘤胃微生物氫化作用。

大量研究表明，脂肪酸參與調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[6-7]。其中，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)能夠促進(jìn)脂滴的合成，顯著促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向脂肪樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[8]；CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CEBPS)是增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族，是脂肪細(xì)胞生成及分化過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子[9]；短鏈脂肪酸受體(GPR43)與脂肪細(xì)胞的分化有著密切的相關(guān)性，三者都對(duì)脂肪的調(diào)控有著重要的作用。

目前，關(guān)于補(bǔ)飼亞麻籽對(duì)肉牛脂肪組織代謝影響的報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)通過(guò)在延邊黃牛的飼糧中添加不同處理(物理破碎法)的亞麻籽，探究其對(duì)延邊黃牛肌肉組織及皮下脂肪中的脂肪酸組成及其相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康無(wú)病、平均體重在480 kg、體況相近的延邊黃牛閹牛30頭。由延邊大學(xué)延邊黃?？萍际痉秷@提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將30頭延邊黃牛閹牛隨機(jī)分成3組，每組10頭。對(duì)照組(CON)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加8%整粒亞麻籽(WPS組)和8%破碎亞麻籽(PS組)的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)過(guò)程中除飼糧組成不同以外，其他條件均保持一致，以控制單一變量。預(yù)試期10 d，正試期180 d?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

圈舍保持清潔，保證試驗(yàn)動(dòng)物能夠自由飲水，溫度適宜，光照充足，相對(duì)濕度為55%，并且每天在05:00和17:00飼喂精粗混合飼糧，自由采食。

1.4 樣品采集及處理

試驗(yàn)結(jié)束在各組試驗(yàn)牛中分別挑選3頭牛，體況相近，且體重接近各組的平均值，在空腹24 h以后進(jìn)行流水線式屠宰。屠宰結(jié)束后取背最長(zhǎng)肌(第12～13肋骨)肌肉組織和皮下脂肪組織，一部分封袋-20 ℃保存，用于測(cè)定脂肪酸含量；一部分液氮保存，用于測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

分別在試驗(yàn)期開(kāi)始和屠宰前進(jìn)行體重測(cè)定，連續(xù)2 d在早飼前空腹稱重，取平均值計(jì)算平均日采食量。每天精準(zhǔn)稱量并記錄每組試驗(yàn)的投料量與剰料量，并測(cè)定其干物質(zhì)的含量，以計(jì)算每頭牛的平均日采食量，并計(jì)算飼料利用率。

飼料利用率(%)=(平均日增重/ 平均日采食量)×100。

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet:VA 5 000 IU,VD 700 IU,VE 30 IU,Zn 100 mg,Fe 90 mg,Mn 20 mg,Cu 10 mg,I 0.3 mg,Se 0.2 mg。

2)綜合凈能(NEmf)為計(jì)算值，計(jì)算公式為：NEmf=DE×Kmf，Kmf=Km×Kf×1.5/(Kf+0.5×Km)。式中：NEmf是綜合凈能；Kmf是消化能轉(zhuǎn)化為凈能的效率；DE是飼糧消化能；1.5為飼糧水平值；Km和Kf分別是消化能轉(zhuǎn)化為維持凈能的效率和消化能轉(zhuǎn)化為增重凈能的效率。The combined net energy (NEmf) is a calculated value. The calculation formula is: NEmf=DE×Kmf，Kmf=Km×Kf×1.5/(Kf+0.5×Km). In the formula: NEmfis the combined net energy, Kmfis the efficiency of the conversion of digestible energy into net energy, DE is the digestibility energy of diets, and 1.5 is the dietary level value. Kmand Kfare the efficiency of digestive energy conversion to maintain net energy and net energy for gain, respectively.

1.5.2 肌肉組織及皮下脂肪中脂肪酸含量的測(cè)定

提取脂肪：磨碎樣品，取1 g于50 mL離心管中，加內(nèi)標(biāo)1 mL，再用15 mL萃取液萃取，即氯仿甲醇(氯仿∶甲醇=2∶1)，再用攪拌器充分?jǐn)嚢?，熱水沖洗后用氯仿甲醇沖洗，充分提取，振蕩1 h，再加入10 mL 0.88%的氯化鈉，漩渦振蕩并離心，取上清液于酯化管中。

酯化過(guò)程：將酯化管中的上清液進(jìn)行氮吹，在氮吹儀上55 ℃恒溫吹干，自然冷卻，加4 mL鹽酸甲醇，75 ℃水浴鍋中催化，再冷卻至室溫，加入2 mL正己烷，漩渦振蕩后靜止0.5 h，加4 mL飽和氯化鈉，振蕩?kù)o置待分層，離心，取上清液，使用安捷倫氣相色譜儀GC-7890A測(cè)定脂肪酸含量。

1.5.3 肌肉組織及皮下脂肪相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

總RNA提取和cDNA合成：使用Promega Eastep的總RNA提取的試劑盒來(lái)提取肌肉和脂肪組織中的總RNA。再根據(jù)TaKaRa RR047A(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)試劑盒說(shuō)明書，建立20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，4 ℃保存。

表2 RT-PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛脂肪酸每日攝取量的影響

由表3可知，添加亞麻籽以后，與CON組比較，WPS組和PS組的黃牛每日攝入的脂肪酸含量均增加，其中C6∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶2n-6、C18∶3n-3和C18∶3n-6含量顯著增加(P<0.05)。

2.2 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)性能的影響

由表4可知，與CON組相比，WPS組和PS組的平均日增重分別顯著提高了6.25%和16.67%(P<0.05)，但WPS組和PS組的平均日增重差異不顯著(P>0.05)；WPS組和PS組的平均日采食量分別顯著提高了6.02%和15.05%(P<0.05)，但WPS組和PS組的平均日采食量差異不顯著(P>0.05)；WPS組和PS組的飼料利用率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛肌肉組織中脂肪酸組成的影響

由表5可知，與CON組相比，WPS組和PS組C16∶0和C18∶0為主的飽和脂肪酸含量顯著下降(P<0.05)，以C18∶1n-9、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶2trans-10,cis-12為主的單不飽和脂肪酸含量顯著上升(P<0.05)，單不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸顯著上升(P<0.05)。

表3 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛脂肪酸每日攝取量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表4 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)性能的影響

表5 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛肌肉組織中脂肪酸組成的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items組別 GroupsCONWPSPSC18∶2n-66.69±0.037.14±0.467.38±0.02C18∶2cis-9,trans-11 1.09±0.04b1.68±0.03a1.61±0.97aC18∶2trans-10,cis-12 1.46±0.27b2.66±0.08a1.99±0.92bC18∶3n-34.56±0.020.93±0.231.09±0.08C20∶00.02±0.050.04±0.020.04±0.92C20∶21.51±0.541.52±0.041.70±0.54C22∶03.52±0.053.99±0.524.01±0.22C20∶4n-60.01±0.240.02±0.040.02±0.85C20∶5n-30.02±0.540.03±0.250.03±0.74C22∶ln-90.87±0.711.05±0.541.07±0.56C22∶6n-30.02±0.590.02±0.360.02±0.35飽和脂肪酸 SFA43.16±0.34a34.83±0.59b34.78±0.46b單不飽和脂肪酸 MUFA43.45±0.37b50.20±0.74a50.47±0.34a單不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸 MUFA/SFA1.00±0.01a1.44±0.23b1.45±0.14b

2.4 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛皮下脂肪中脂肪酸組成的影響

由表6可知，與CON組相比，WPS組和PS組單不飽和脂肪酸C18∶ln-9、C18∶2n-6、C18∶2cis-9，trans-11、C18∶3n-3的含量顯著上升(P<0.05)，飽和脂肪酸C10∶0、C12∶0、C16∶0、C18∶0含量顯著下降(P<0.05)。

表6 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛皮下脂肪中脂肪酸組成的影響

續(xù)表6項(xiàng)目Items組別 GroupsCONWPSPS飽和脂肪酸 SFA43.66±4.0239.52±7.2640.31±5.49單不飽和脂肪酸 MUFA43.49±7.6446.63±6.2147.62±4.85單不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸MUFA/SFA0.99±0.791.18±0.861.18±0.88

2.5 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛肌肉組織中相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表7可知，與CON組相比，WPS組和PS組的4種基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，其中PS

組的GPR43和CEBPα基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，WPS組的SREBP和CEBPβ基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。

表7 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛肌肉組織中相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛皮下脂肪中相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表8可知，與CON組相比，WPS組GPR43和CEBPα基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，而PS組SREBP和CEBPβ基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。

表8 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛皮下脂肪中相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)中不同處理的亞麻籽均使延邊黃牛的平均日增重升高，這與Raes等[10]在飼糧中添加不同處理的亞麻籽可提高肉牛的日増重結(jié)果一致。Landblom等[11]在飼糧中添加12.5%亞麻籽可顯著提高肉牛的日增重。李建國(guó)等[12]研究也顯示，飼糧中添加亞麻籽可增加能量利用率從而提高日增重。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加亞麻籽可提高平均日采食量，這與許蕾蕾等[13]研究結(jié)果相一致。在飼糧中添加亞麻籽可增加不飽和脂肪酸的含量，從而提高平均日采食量和平均日增重，對(duì)飼料利用率無(wú)顯著影響。但目前大量研究表明，在飼糧中添加亞麻籽對(duì)動(dòng)物采食量的影響結(jié)果不一致。Cooper等[14]研究結(jié)果顯示，動(dòng)物采食量和生長(zhǎng)性能與油料作物關(guān)系影響不大。所以，今后還將繼續(xù)研究在飼糧中添加亞麻籽對(duì)肉牛采食量的相關(guān)性影響。

3.2 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛肌肉組織及皮下脂肪中脂肪酸組成的影響

亞麻籽中有大量的油脂，而油脂內(nèi)的不飽和脂肪酸含量高達(dá)80%，其中α-亞麻酸占據(jù)主體，還有大量的亞油酸[15]。在反芻動(dòng)物的瘤胃中亞麻酸會(huì)通過(guò)瘤胃微生物的不完全氫化作用生成共軛脂肪酸(CLA和CLNA)，這2種不飽和脂肪酸在反芻動(dòng)物的體內(nèi)非常重要，有很好的研究前景。而共軛脂肪酸的形成有2種途徑，內(nèi)源合成和瘤胃的不飽和氫化作用。

亞麻酸是反芻動(dòng)物內(nèi)源合成共軛亞麻酸的前體物，亞麻籽中的α-亞麻酸和亞油酸分別是n-3多不飽和脂肪酸和n-6多不飽和脂肪酸的合成前體，由于動(dòng)物不能自身合成，所以亞麻酸是動(dòng)物機(jī)體的必需脂肪酸[16]。羅何峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加n-3不飽和脂肪酸能夠調(diào)控動(dòng)物機(jī)體脂肪代謝的相關(guān)基因的表達(dá)，繼而影響動(dòng)物機(jī)體的體脂沉積。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，WPS組和PS組延邊黃牛肌肉組織中C16∶0和C18∶0為主的飽和脂肪酸含量顯著下降，以C18∶1n-9、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶2trans-10,cis-12為主的單不飽和脂肪酸含量顯著上升。與CON組相比，WPS組和PS組延邊黃牛皮下脂肪中C18∶ln-9、C18∶2n-6、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶3n-3等單不飽和脂肪酸的含量顯著上調(diào)，C16∶0，C18∶0等飽和脂肪酸含量顯著下調(diào)。這與張玉斌等[18]發(fā)現(xiàn)奶牛飼糧中添加油籽能夠降低乳脂中C10∶0、C12∶0、C14∶0以及C16∶0等含量，增加C18∶1和C18∶1trans-11含量的結(jié)果一致。這說(shuō)明飼糧中添加亞麻籽，確實(shí)改變了脂肪酸的組成，增加了亞麻酸在瘤胃中的飽和氫化作用，從而提高了不飽和脂肪酸的含量。亞麻籽補(bǔ)充劑促進(jìn)飲食脂質(zhì)的攝取，同時(shí)控制脂肪組織中的脂肪酸生物合成，這與于伽等[19]研究的結(jié)果保持一致。

3.3 飼糧中添加亞麻籽對(duì)延邊黃牛肌肉組織及皮下脂肪中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

GPR43、SREBP、CEBPS等基因在細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)化途徑中可以被脂肪酸的組成所影響，它們參與脂肪細(xì)胞合成與分化的調(diào)控機(jī)制，與脂滴的聚積有著密切的關(guān)系[20]。其中，GPR43基因廣泛存在于機(jī)體的脂肪組織、腸胃環(huán)境、免疫細(xì)胞等不同的組織和細(xì)胞之中，它能夠被短鏈脂肪酸激活[21]。在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，GPR43基因主要在小鼠的白色脂肪組織中表達(dá)，并且其在脂肪細(xì)胞中表達(dá)的水平要比其在血管基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量高[22]。

GPRS是蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，在介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要的調(diào)控作用。由于其編碼基因的位置在特定染色體上，所以其被稱為特異性受體，又叫為游離脂肪酸受體[23]。又因?yàn)檫@種受體在機(jī)體很多組織包括脂肪、免疫細(xì)胞、肺等組織中表達(dá)，因此具有許多的生物學(xué)功能，參與了細(xì)胞的脂質(zhì)代謝、免疫細(xì)胞的分化等過(guò)程。短鏈脂肪酸(SCFAs)不僅能為機(jī)體供能，還有很重要的生理調(diào)控作用，例如調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、免疫反應(yīng)和脂類的代謝等[24]。研究表明，GPR43是SCFAs的受體，SCFAs能與GPR43結(jié)合發(fā)揮很重要的生理功能。GPR43與脂肪細(xì)胞的分化有著密切的相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，WPS組和PS組肌肉組織中GPR43基因表達(dá)量下調(diào)，而皮下脂肪中的GPR43基因表達(dá)量上調(diào)。脂肪酸組成中單不飽和脂肪酸含量上升，飽和脂肪酸含量下降，同時(shí)相關(guān)基因GPR43基因的表達(dá)發(fā)生了變化，在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量更高，在肌肉中的表達(dá)量則下降，說(shuō)明添加亞麻籽可以使脂肪酸組成發(fā)生變化，調(diào)控延邊黃牛的脂質(zhì)代謝。這與王蔚盈[25]研究結(jié)果基本一致。

SREBP是機(jī)體重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與機(jī)體脂肪生成基因的調(diào)節(jié)有很重要的相關(guān)性，有大量的研究表明，SREBP可以直接激活脂肪酸、膽固醇、甘油三酯以及磷脂的生物合成及攝取過(guò)程中的30多個(gè)基因及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的表達(dá)[26]，SREBP1或SREBP2基因的增加顯著促進(jìn)細(xì)胞脂滴的積累[27]。李麗等[28]研究發(fā)現(xiàn)SREBP第5內(nèi)含子與C16∶1、C18∶0、SFA和甘油三酯及C16脂肪酸不飽和指數(shù)有顯著的相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在飼糧中添加亞麻籽，與CON組相比，試驗(yàn)組的SREBP基因表達(dá)量顯著上升，而C16∶1和C18∶0等飽和脂肪酸含量又呈顯著下降趨勢(shì)，C18∶ln-9、C18∶2n-6、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶3n-3等單不飽和脂肪酸含量顯著上升，說(shuō)明基因表達(dá)量的變化與脂肪酸結(jié)構(gòu)的存在相關(guān)性。

CEBPS是脂肪細(xì)胞生成及分化過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子[29]。而CEBPA基因和CEBPB基因都是CEBPS家族成員，在脂肪等組織的生長(zhǎng)、分化及代謝中至關(guān)重要[30]。CEBPA對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表現(xiàn)在2個(gè)方面，即轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制，同時(shí)也在細(xì)胞的增殖分化、能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等方面有重要作用[31]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與CON組相比，在飼糧中添加亞麻籽顯著提高CEBPA和CEBPB基因的表達(dá)，試驗(yàn)組的單不飽和脂肪酸含量也顯著上升，說(shuō)明飼糧添加亞麻籽可以調(diào)控脂肪酸的組成及相關(guān)基因的表達(dá)量。

4 結(jié) 論

① 在飼糧中添加亞麻籽，不僅可以增加延邊黃牛的平均采食量和平均日增重，而且改變了肌肉及脂肪中脂肪酸的組成，并且調(diào)控了GPR43、SREBP、CEBPα和CEBPβ基因的表達(dá)量。

② 在本試驗(yàn)條件下，破碎處理的亞麻籽(即PS組)添加效果更好，有益于延邊黃牛生長(zhǎng)性能的提高和脂肪代謝的調(diào)控。