陳小軍 王 宇 王帥帥 伍 勇 李元義 孫志良*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙410128；2.湖南省獸藥工程技術研究中心，長沙410128； 3.加拿大麥吉爾大學健康研究中心，蒙特利爾H3G 1A4)

鉤吻，別名斷腸草、大茶藥、葫蔓藤等，為馬前科植物葫蔓藤的全草，我國浙江、福建、廣東、廣西、云南、貴州等省有廣泛分布。鉤吻是世界有名的劇毒植物，對人有大毒，內(nèi)服鉤吻莖葉10 g或根2～8 g即能引起中毒[1]，甚至死亡，呼吸衰竭是鉤吻中毒最主要的死亡原因[2]。吲哚類生物堿為其主要化學成分，也是主要毒性和活性成分，其中鉤吻素子含量最高，鉤吻素寅毒性最強[3]。隨著對鉤吻毒性了解的深入，鉤吻的應用研究日趨廣泛，已從過去僅供外用發(fā)展到用于抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面[4-7]。雖然對人來說是劇毒，但鉤吻對牛、豬、羊等不顯劇毒，合適劑量時反而有增肥和防瘟之效?！稄V東中獸醫(yī)常用草藥》記載：“鉤吻，常定期對豬羊服本藥，可以健胃，殺蟲，催肥”?？梢?，鉤吻是一個相當有發(fā)展前景的中草藥添加劑，研究其促生長作用及機制對其開發(fā)應用十分重要。我國應用鉤吻促進動物生長的歷史悠久，廣東、福建等地將鉤吻稱作豬人參，常將鉤吻曬干粉碎混于飼糧中喂豬以催肥。研究表明，復方豬人參可使仔豬日增重提高16.6%，飼料轉(zhuǎn)化率提高18.2%[8]。鉤吻干粉、鉤吻總堿和鉤吻注射液促仔豬生長的研究發(fā)現(xiàn)，三者均增重效果顯著，同等劑量下鉤吻總堿因體積小、適口性好，增重效果優(yōu)于粉劑和注射劑[9]。由于不同種類生物堿的結(jié)構(gòu)類型、理化性質(zhì)等具有差異性，不同方法所得鉤吻提取物的總堿得率和活性也有差異，其促生長效果也不盡相同。目前對鉤吻促豬生長的研究較少，且主要集中在鉤吻粉或鉤吻復方的有效性方面，未見不同鉤吻提取物對豬促生長效果及機制的比較研究。本試驗通過在生長豬飼糧中添加鉤吻醇提物和鉤吻酸提物，比較研究其促生長效果，以及對生長豬生長性能、腸道形態(tài)和盲腸菌群的影響，為鉤吻提取物作為飼料添加劑的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鉤吻醇提物和鉤吻酸提物均由湖南泰谷生物科技股份有限公司提供。鉤吻醇提物采用乙醇(95%)熱提取，總生物堿含量為6.44%。鉤吻酸提物采用硫酸(0.5%)熱提取，用氫氧化鈉(8 mol/L)調(diào)pH至中性，總生物堿含量為2.15%。2種鉤吻提取物減壓干燥后粉碎，分裝備用。供試生長豬、基礎飼糧和試驗場地均由湖南新五豐股份有限公司永安分公司提供。

1.2 試驗設計

選取75頭健康、體重[(18.63±0.36) kg]相近、56日齡的“長×大”二元雜交生長豬，采用單因素試驗設計，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復5頭，每個重復為1圈。根據(jù)預試驗結(jié)果，確定3個鉤吻醇提物組分別在基礎飼糧中添加25(低劑量)、50(中劑量)、100 mg/kg(高劑量)鉤吻醇提物，1個鉤吻酸提物組在基礎飼糧中添加150 mg/kg鉤吻酸提物。對照組飼喂基礎飼糧，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期為49 d。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 13 500 IU，VD32 250 IU，VE 24 mg，VK33 mg，VB13 mg，VB26 mg，VB63 mg，VB120.025 mg,D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg，葉酸 folic acid 1.2 mg，生物素 0.15 mg，F(xiàn)e(as ferrous sulfate)100 mg，Cu (as copper sulfate) 150 mg，Mn (as manganese sulfate) 30 mg，Zn (as zinc sulfate) 100 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg，I (as potassium iodide) 0.5 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 飼養(yǎng)管理

各組試驗豬每天定時喂料，自由采食，自由飲水，其他免疫、消毒、衛(wèi)生等飼養(yǎng)管理依常規(guī)進行。

1.4 生長性能測定

分別于試驗第1、15、31、49天，每天08:00空腹稱重，每日準確記錄飼料消耗量，計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G)。每日觀察試驗豬排糞情況，記錄腹瀉個體、腹瀉次數(shù)，以組為單位計算腹瀉率，每日觀察豬只睡眠情況。

1.5 腸道形態(tài)學觀察

1.5.1 腸道形態(tài)的光鏡觀察

試驗第49天，從每組每個重復隨機選取2頭接近平均體重的試驗豬，禁食12 h后稱重，戊巴比妥鈉完全麻醉后，剖開腹腔，迅速取出小腸，排盡全部食糜，分別截取十二指腸、空腸、回腸中段約10 cm，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，剪取2 cm放入10%甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色處理后于光學顯微鏡下觀察，采用圖像分析軟件測定絨毛高度和隱窩深度，計算絨毛高度/隱窩深度。每個樣本觀察3張非連續(xù)切片，每張切片選取3個完整、典型的絨毛視野，每個視野測定10個絨毛長度和隱窩深度，其平均值作為1個測定數(shù)據(jù)。

1.5.2 腸道超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

用冰磷酸鹽緩沖液反復漂洗空腸組織樣本，2.5%戊二醛固定后，磷酸鹽緩沖液清洗，1%鋨酸固定，經(jīng)脫水、置換、包埋、切片、染色、清洗后，置于日立H-77700透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.6 盲腸菌群數(shù)量測定

分離、結(jié)扎盲腸段，酒精棉球消毒結(jié)扎口后置于滅菌塑料袋中，在超凈工作臺中無菌采取盲腸內(nèi)容物放入滅菌的離心管中，并將同組豬盲腸內(nèi)容物均勻混合，進行10倍梯度稀釋，根據(jù)預試驗結(jié)果，選擇10-4、10-5、10-63個濃度分別滴種于EMB(大腸桿菌)和LBS(乳酸桿菌)培養(yǎng)基上，將滴種后的EMB培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將滴種后的LBS培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每個濃度設5個重復，計數(shù)平板菌落數(shù)，取平均值，結(jié)果以每克盲腸內(nèi)容物中菌落總數(shù)的對數(shù)[lg(CFU/g)]表示。

建筑工程的質(zhì)量關系著人民百姓的生命安全，需要從業(yè)者予以重視，要在意識層面上使房屋建筑管理人員具有質(zhì)量管理與安全責任意識，對工程中每一個環(huán)節(jié)進行嚴格的把控。土建施工過程復雜，施工質(zhì)量問題有可能會出現(xiàn)在所有的施工環(huán)節(jié)之中，對質(zhì)量控制工作落實的好壞會對整個建筑工程的質(zhì)量造成影響。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0中的ANOVA程序進行單因素方差分析，以LSD法進行多重比較。結(jié)果采用平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著性標準。

2 結(jié) 果

2.1 鉤吻提取物對生長豬生長性能的影響

由表2可知，試驗第1～15天，飼糧添加鉤吻提取物對生長豬ADFI有顯著提高(P<0.05)，但在整個試驗期間(第1～49天)各組ADFI無顯著差異(P>0.05)。整個試驗期間，各鉤吻提取物添加組的ADG均顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)/G均顯著低于對照組(P<0.05)；鉤吻醇提物3個劑量組與鉤吻酸提物組間ADG無顯著差異(P>0.05)；鉤吻醇提物高劑量組的ADG在數(shù)值上高于中、低劑量組(P>0.05)，具明顯的劑量依賴性；鉤吻酸提物組與鉤吻醇提物低劑量組的F/G差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于鉤吻醇提物中、高劑量組(P<0.05)。整個試驗期間對照組和各鉤吻提取物添加組試驗豬均無死亡、腹瀉等不良情況，豬群健康狀況良好。

2.2 鉤吻提取物對生長豬腸道形態(tài)的影響

2.2.1 光學顯微鏡觀測結(jié)果

由表3可知，飼糧添加鉤吻提取物后生長豬十二指腸、空腸、回腸絨毛高度均有不同程度的增加。各鉤吻提取物添加組十二指腸絨毛高度與對照組相比無顯著變化(P>0.05)，鉤吻醇提物高劑量組和鉤吻酸提取組空腸絨毛高度顯著高于對照組和鉤吻醇提物中、低劑量組(P<0.05)，鉤吻醇提物高劑量組回腸絨毛高度顯著高于對照組和其他鉤吻提取物添加組(P<0.05)。飼糧添加鉤吻提取物后生長豬十二指腸、空腸、回腸隱窩深度均有不同程度的降低，但與對照組相比，僅鉤吻醇提物高劑量組十二指腸隱窩深度的降低程度達到顯著水平(P<0.05)。十二指腸、空腸、回腸絨毛高度/隱窩深度各組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 透射電鏡觀察結(jié)果

在透射電鏡下觀察，與對照組相比，各鉤吻提取物添加組空腸組織微絨毛更加均勻、整齊、致密，相鄰細胞間的緊密連接、中間連接和橋粒等結(jié)構(gòu)均結(jié)構(gòu)清晰、完整。對照組和鉤吻醇提物高劑量組透射電鏡下空腸黏膜組織結(jié)構(gòu)見圖1。

2.3 鉤吻提取物對生長豬盲腸中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的影響

由表4可知，與對照組相比，鉤吻醇提物中、低劑量組生長豬盲腸中大腸桿菌的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加(P<0.05)，且鉤吻醇提物對乳酸桿菌的增殖作用有明顯的劑量依賴性。飼糧中添加鉤吻酸提物能降低盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，增加乳酸桿菌的數(shù)量，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 鉤吻提取物對生長豬生長性能的影響

劉道榮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加鉤吻粉(20、40 g/kg)能提高ADG，降低F/G，且隨添加劑量增加效果增強，添加鉤吻粉與添加鉤吻總堿(0.22 g/kg，乙醇提取)或注射鉤吻注射液[2 mL/(頭·d)]相比，鉤吻粉劑與鉤吻注射劑之間ADG無顯著差異，鉤吻總堿ADG則顯著高于鉤吻粉劑與鉤吻注射劑，說明鉤吻發(fā)揮促生長作用的主要成分為生物堿。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，鉤吻醇提物和鉤吻酸提物均能顯著提高生長豬的ADG，顯著降低F/G，鉤吻醇提物的促生長作用與添加劑量呈正相關；鉤吻酸提物組(150 mg/kg)與鉤吻醇提物低劑量組(25 mg/kg)的F/G差異不顯著，但二者均顯著低于鉤吻醇提物中、高劑量組(50、100 mg/kg)，可能與總生物堿含量相關。張冬英等[10]研究表明，基礎飼糧中添加1.5%、3.0%的鉤吻干粉可顯著促進肉雞生長，但添加劑量達到6.0%時，肉雞生長緩慢，出現(xiàn)明顯的中毒癥狀。本研究中，飼糧中添加100 mg/kg鉤吻醇提物和150 mg/kg鉤吻酸提物分別約相當于添加0.16%和0.08%鉤吻干粉，生長豬未出現(xiàn)中毒癥狀，鉤吻提取物對生長豬的中毒劑量仍需進一步摸索。

表2 鉤吻提取物對生長豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 鉤吻提取物對生長豬腸道形態(tài)的影響

續(xù)表3項目Items對照組Control group鉤吻醇提物組Gelsemium elegans alcohol extract groups低劑量 Low-dose中劑量Mid-dose高劑量 High-dose鉤吻酸提物組Gelsemium elegansacidic extract group絨毛高度/隱窩深度Villus length/crypt depth3.57±0.853.80±0.744.56±1.223.03±0.713.54±0.83空腸 Jejunum絨毛高度 Villus length/μm320.00±18.08a326.00±27.10a334.55±25.09a508.10±30.07b436.52±21.08b隱窩深度 Crypt depth/μm88.39±13.6284.56±9.8179.56±8.0380.47±7.0179.37±5.02絨毛高度/隱窩深度Villus length/crypt depth4.12±2.045.13±1.044.89±1.105.09±1.084.78±1.04回腸 Ileum絨毛高度 Villus length/μm314.42±10.35a344.61±22.06a328.58±12.38a390.54±13.17b334.59±20.05a隱窩深度 Crypt depth/μm98.69±7.0290.44±12.0190.28±11.6295.43±11.6396.71±14.37絨毛高度/隱窩深度Villus length/crypt depth3.55±0.903.77±0.903.70±0.804.39±1.404.00±0.90

圖1 透射電鏡下空腸黏膜組織結(jié)構(gòu)

鉤吻對人有大毒，鉤吻生物堿的中毒機制包括抑制膽堿酯酶活性，引起外周植物神經(jīng)M樣效應，抑制呼吸中樞，抑制腦和脊髓的運動中樞，使呼吸肌麻痹，導致呼吸衰竭。近年來，對鉤吻的研究逐漸廣泛且深入，發(fā)現(xiàn)鉤吻具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、促進造血功能等作用，尤其在延長肝癌患者生存期和腫瘤患者鎮(zhèn)痛方面作用顯著[11]，臨床上也已用鉤吻素甲治療神經(jīng)痛，說明對鉤吻毒性的了解在逐漸深入。臨床中鉤吻中毒患者大部分為誤食或聽信偏方擅自服用鉤吻，盡管廣東、福建等地民間使用鉤吻拌飼催肥相當普遍，但尚未見因食用動物性食品發(fā)生鉤吻中毒的報道，可能與鉤吻在豬、雞等動物體內(nèi)消除速度快有關。這一推測被殘留學和代謝學研究所證實。據(jù)報道，在肉雞肝臟及肌肉(飼喂含2%鉤吻粉的基礎飼糧，連續(xù)60 d)[12]、豬肌肉(飼喂含0.2%鉤吻粉的基礎飼糧，連續(xù)40 d)中均未檢測到鉤吻生物堿[13]。代謝學研究進一步證實，給大鼠口服10 mg/kg鉤吻生物堿，血漿中鉤吻素甲和鉤吻素子的峰時分別為0.43和0.28 h，其半衰期(t1/2)分別為1.59和1.60 h，說明鉤吻生物堿吸收和消除都很迅速[14]。體外研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子在豬肝S9中主要代謝途徑有氧化、還原、脫氫、去甲基，鉤吻素甲在豬肝S9中主要代謝途徑有氧化、去甲基[15]，說明鉤吻生物堿代謝途徑豐富，這可能是其消除速度較快的原因之一。以上結(jié)果說明鉤吻是一種安全、可靠的中草藥飼料添加劑，但鉤吻作為飼料添加劑，仍需更系統(tǒng)地研究闡明其安全性，這將是本課題組下一步的研究內(nèi)容。

本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加鉤吻提取物對生長豬的ADFI無顯著影響。韓瑞麗等[16]研究表明，飼糧中添加不同劑量(0.4%、0.8%、1.2%、1.6%)的鉤吻粉均能提高固始雞的ADG，但降低ADFI，且ADFI的降低與鉤吻添加劑量呈正相關，推測可能是因鉤吻適口性較差。由于本試驗添加的是鉤吻提取物，且添加劑量較低，不便推測是否影響適口性。有研究認為，鉤吻的促生長作用與增加食欲有關，試驗豬“食欲明顯旺盛，表現(xiàn)饑俄、吼叫、搶食、槽內(nèi)舔光”[17]，但在本試驗中，各鉤吻提取物添加組試驗豬與對照組在食欲方面無明顯差異，未觀察到鉤吻提取物添加組豬只有上述表現(xiàn)?！稄V西中藥志》曾載：“當豬胃納不良時，用以飼喂，能增進食欲”，鉤吻是否對健康豬和胃納不良豬均能增進食欲，尚需進一步試驗觀察。

在安靜狀態(tài)下動物基礎代謝降低，有利于營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)沉積，從而促進生長。研究表明，鉤吻總堿能顯著增強戊巴比妥鈉對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠效果[18]，灌胃較高劑量(10.0 mg/kg)的鉤吻素子能增強閾下劑量戊巴比妥鈉對小鼠的催眠作用，而灌胃2.5 mg/kg劑量的鉤吻素子則無此效應[19]，但靜脈注射2.36 mg/kg的鉤吻素子即對小鼠有鎮(zhèn)靜作用[20]。據(jù)此人們推測，鉤吻的促生長作用與鎮(zhèn)靜、催眠有關[17,21]。但在本試驗中，各鉤吻提取物添加組豬只睡眠情況與對照組并無明顯差異，也許與本試驗中鉤吻提取物添加劑量遠未達到鎮(zhèn)靜催眠劑量有關。

3.2 鉤吻提取物對生長豬腸道形態(tài)的影響

小腸是機體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，絨毛高度、隱窩深度等是衡量小腸消化吸收功能的重要指標。隱窩深度反映細胞的生成率，隱窩變淺，表明細胞成熟率升高，分泌功能增強，絨毛高度/隱窩深度可綜合反映小腸的功能狀態(tài)，比值升高，表明消化吸收功能增強[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg鉤吻醇提物能顯著增加生長豬空腸和回腸絨毛高度，顯著降低十二指腸隱窩深度，150 mg/kg鉤吻酸提物可顯著增加空腸絨毛高度，表明鉤吻提取物可促進小腸絨毛的生長發(fā)育，改善小腸黏膜結(jié)構(gòu)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗結(jié)果支持韓瑞麗等[16]的推測，即鉤吻的促生長作用可能主要與其促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收有關。

3.3 鉤吻提取物對生長豬盲腸菌群的影響

盲腸是微生物大量生長與繁殖的場所，腸道菌群是構(gòu)筑腸道黏膜屏障的主要組分，與機體的營養(yǎng)、免疫、疾病防治及生理功能的發(fā)揮關系密切。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加50、100mg/kg鉤吻醇提物可顯著促進盲腸中乳酸桿菌的生長，并抑制大腸桿菌的生長，劉小艷[12]也證實鉤吻總堿劑量依賴性地降低肉雞回腸中大腸桿菌的數(shù)量，增加乳酸桿菌的數(shù)量。但體外抑菌試驗結(jié)果與之不符，對沙門氏菌、非致病性大腸桿菌、糞鏈球菌和枯草芽孢桿菌進行體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)葫蔓藤(即鉤吻)乙醇提取液(0.4 g/mL)對上述細菌的數(shù)量均無顯著影響[13]。鉤吻醇提物中生物堿、糖類和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分高于鉤吻酸提物[23]，為腸道微生物提供了更豐富的營養(yǎng)環(huán)境，有效促進了盲腸乳酸桿菌的生長，乳酸桿菌則通過產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸等有機酸及過氧化氫等，抑制大腸桿菌等病原菌的增殖。因此，盡管鉤吻醇提物體外無抑菌活性，但在體內(nèi)可通過促進有益菌的增殖而增強與有害菌的競爭力，從而改善腸道微生態(tài)平衡和腸道形態(tài)，且其調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)能力優(yōu)于鉤吻酸提物。

4 結(jié) 論

鉤吻醇提物和鉤吻酸提物可改善生長豬的腸道形態(tài)，增加盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量，進而提高生長豬的ADG，降低F/G，以100 mg/kg鉤吻醇提物的效果最佳。