王特日格樂 王翠芳 丹 妮 薩茹麗 杜紅喜 郭春利 哈斯額爾敦 曹琪娜 敖長(zhǎng)金

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

炎癥是人和動(dòng)物常見的病理過程，并出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、癢等典型癥狀。在炎癥發(fā)生過程中，致炎因素導(dǎo)致的組織損傷和機(jī)體啟動(dòng)的抗損傷之間的優(yōu)勢(shì)對(duì)比決定著炎癥的發(fā)展方向和結(jié)局[1]。炎癥發(fā)生后，一般采用傳統(tǒng)的抗炎藥物進(jìn)行治療，雖然這些藥物的抗炎效果較好，但是副作用也較大，因此，研發(fā)安全無(wú)副作用的替代品成為了新的熱點(diǎn)。病原微生物引起的炎癥過程中，致使單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的增生。巨噬細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞，當(dāng)其受到外界抗原刺激時(shí)會(huì)釋放白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等一系列炎性細(xì)胞因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷[2]。局部炎癥反應(yīng)也會(huì)影響到整個(gè)機(jī)體，從而產(chǎn)生不同程度的全身性反應(yīng)，但機(jī)體本身的狀態(tài)能夠制約局部炎癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。所以，巨噬細(xì)胞對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，維持機(jī)體免疫、抗炎等方面有著重要作用[4]。沙蔥，屬百合科、蔥屬，學(xué)名蒙古韭，具有藥用價(jià)值和功效[5]。沙蔥提取物含有酮類、醛類、糖類等多種活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物是重要的成分之一[6]。黃酮類化合物是一類重要的含氧雜環(huán)天然有機(jī)化合物，并具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌等作用[7-9]。所以，本研究以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為炎癥模型，探討沙蔥總黃酮的抗炎效果，為沙蔥黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物及試劑

沙蔥總黃酮[由本實(shí)驗(yàn)室自己提取制備，提取率為(12.85±0.03) mg/g[10]]、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(7017946，BD)、LPS(L2880，Sigma)、胎牛血清(FBS，F(xiàn)ND500，ExCell Bio)、RPMI-1640培養(yǎng)基(C11875500BT，Gibco)、CCK-8(ck04，東仁化學(xué)科技有限公司)、二甲基亞砜(DMSO，D8371，Solarbio)、一氧化氮(NO)試劑盒(G2930，Promega)、RNA提取試劑盒(Axygen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)、PCR試劑盒(RR820A，TaKaRa)、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(430904，Biolegend)、IL-6 ELISA試劑盒(431304，Biolegend)、IL-10 ELISA試劑盒(88-7105，Invitrogen)、IL-1β ELISA試劑盒(432604，Biolegend)。

1.3 試驗(yàn)儀器

SynergyHT酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)、IX51倒置顯微鏡(奧林巴斯科技有限公司)、Roche480 PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)、低溫離心機(jī)(上海鋪澤商貿(mào)有限公司)。

1.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)

取6～8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，向其腹腔內(nèi)注射3%的液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG) 2 mL，刺激72 h，脫頸法處死，于75%乙醇中浸泡2～3 min，在無(wú)菌超凈臺(tái)里暴露小鼠腹腔，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 mL，收集灌洗液，將灌洗液在5 000 r/min、4 ℃條件下離心3 min，棄上清，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)[11-12]。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖率

將細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種于96孔板，貼壁2 h后，對(duì)照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基[13]，各沙蔥總黃酮組加入不同濃度的沙蔥總黃酮溶液，使其終濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL，分別培養(yǎng)24 h，再加入100 μL含10% CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值。

1.5.2 Griess法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO含量

將細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于24孔板，貼壁2 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，分為對(duì)照組、LPS組(應(yīng)激模型組，1 μg/mL LPS)[14-16]、沙蔥總黃酮低劑量組(25 μg/mL沙蔥總黃酮+1 μg/mL LPS)、沙蔥總黃酮中劑量組(50 μg/mL沙蔥總黃酮+1 μg/mL LPS)、沙蔥總黃酮高劑量組(100 μg/mL沙蔥總黃酮+1 μg/mL LPS)。對(duì)照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，LPS組添加終濃度為1 μg/mL的LPS，各沙蔥總黃酮組先用不同濃度沙蔥總黃酮溶液對(duì)細(xì)胞預(yù)處理1 h后再添加1 μg/mL的LPS共同處理24 h。收集細(xì)胞上清液，用Griees法測(cè)定NO含量。

1.5.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法測(cè)定細(xì)胞中TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶(iNOS) mRNA表達(dá)

將細(xì)胞以2.5×106個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組同上，培養(yǎng)2 h后將培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基棄掉，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，對(duì)照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，LPS組添加終濃度為1 μg/mL的LPS，各沙蔥總黃酮組先用不同濃度沙蔥總黃酮溶液對(duì)細(xì)胞預(yù)處理1 h后再添加1 μg/mL的LPS共同處理4及12 h。培養(yǎng)4及12 h后，棄掉細(xì)胞上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，添加細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞，1.5 mL EP管收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書所述方法制備cDNA，通過特異性引物對(duì)細(xì)胞中TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS及其內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)進(jìn)行擴(kuò)增，基因引物序列見表1。本試驗(yàn)RT-PCR采用20 μL試驗(yàn)體系，其中無(wú)酶水6.4 μL,染料10 μL,上、下游引物各0.8 μL及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2 μL。

表1 基因引物序列

1.5.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的含量

將細(xì)胞以2.5×106個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，分組同上，貼壁2 h后用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，對(duì)照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，各沙蔥總黃酮組先用不同濃度沙蔥總黃酮溶液對(duì)細(xì)胞預(yù)處理1 h后再添加1 μg/mL的LPS共同處理24 h，收集細(xì)胞上清液。試驗(yàn)方法按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用SAS 9.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖率的影響

如圖1所示，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，12.5～200.0 μg/mL濃度的沙蔥總黃酮均可顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖率(P<0.05)，在12.5～100.0 μg/mL濃度，隨著沙蔥總黃酮濃度的增加細(xì)胞增值率也逐漸上升，當(dāng)添加濃度為200.0 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中，將沙蔥總黃酮的添加濃度確定為25.0～100.0 μg/mL。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～圖7同。

Data bars with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2 to Fig.7.

圖1沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖率的影響

Fig.1 Effects of total flavonoids fromAlliummongolicumRegel on proliferation ratio of mouse peritoneal macrophages

2.2 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中NO含量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中NO含量顯著提高(P<0.05)；與LPS組相比，不同濃度沙蔥總黃酮均能顯著抑制NO的產(chǎn)生(P<0.05)，并且呈劑量依賴性。

2.3 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表達(dá)的影響

如圖3～圖7所示，在對(duì)照組細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA表達(dá)量較低，但當(dāng)單獨(dú)添加1 μg/mL的LPS對(duì)細(xì)胞刺激培養(yǎng)后，TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的表達(dá)均增加。與LPS組相比，除了低劑量組iNOS外，各濃度沙蔥總黃酮均能顯著抑制細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA的表達(dá)(P<0.05)，并具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。而對(duì)于IL-10來說，在沙蔥總黃酮添加濃度為100 μg/mL時(shí),IL-10 mRNA表達(dá)量最高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，與LPS組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬 細(xì)胞上清液中NO含量的影響Fig.2 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on NO content in the supernatant of mouse peritoneal macrophages

圖3 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 TNF-α mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on TNF-α mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖4 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔 巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on the IL-6 mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖5 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔 巨噬細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on IL-1β mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖6 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔 巨噬細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on IL-10 mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖7 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔 巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on iNOS mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

2.4 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10含量的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，LPS組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及抗炎因子IL-10的含量均顯著提高(P<0.05)；與LPS組相比，除了低劑量組的IL-1β，添加各濃度沙蔥總黃酮均能顯著降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量(P<0.05)；然而IL-10結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加沙蔥總黃酮高、中、低劑量均能不同程度地升高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中IL-10的含量(P<0.05)。

3 討 論

一般情況下，當(dāng)機(jī)體內(nèi)的抗炎因子和促炎因子保持平衡時(shí)，機(jī)體的生理生化功能維持正常。但是當(dāng)體內(nèi)的細(xì)胞因子、炎癥因子等產(chǎn)生過多，超過機(jī)體自身的保護(hù)能力時(shí)，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)炎癥[17]。炎癥是機(jī)體對(duì)外抗衡的一種抗病反應(yīng)，使細(xì)胞表面獲取更多的氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以對(duì)機(jī)體有利。但是在一些外界因素影響下，抗炎因子也可以轉(zhuǎn)化成對(duì)機(jī)體有害的因素。炎癥分為慢性炎癥和急性炎癥，在急性炎癥所產(chǎn)生的高濃度炎癥因子的持續(xù)刺激下，急性炎癥會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的慢性炎癥，慢性炎癥與冠心病、高血壓、甚至癌癥等一些慢性疾病有密切相關(guān)[18]。在炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的活化起著重要的作用，在未受到外界因素刺激時(shí)巨噬細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出免疫功能[19]，但是當(dāng)受到LPS等外界因素的刺激后，被激活的巨噬細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等，這些細(xì)胞因子相互影響，在炎癥中起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，在本研究中選擇在炎癥反應(yīng)中具有代表性的促炎因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α為測(cè)定指標(biāo)，IL-1分為IL-1α和IL-1β 2種，IL-1α是一種結(jié)合性的細(xì)胞，只有與其他細(xì)胞相互結(jié)合后才能發(fā)揮作用；IL-1β在機(jī)體內(nèi)有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，能增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺傷力，引起炎癥反應(yīng)，也能促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)[20]。IL-6在機(jī)體內(nèi)有非常廣泛的作用，在免疫應(yīng)答反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)中起著很大的作用，同時(shí)刺激IL-1受體拮抗劑和可溶性TNF-α受體抑制IL-1、TNF-α等致炎因子的早期合成[21]。IL-10是機(jī)體內(nèi)一種具有雙重作用的細(xì)胞因子，既有抑制免疫作用也有免疫刺激作用。IL-10還可以抑制單核巨噬細(xì)胞免疫介質(zhì)的釋放，同時(shí)抑制促炎細(xì)胞因子的釋放[22]。TNF-α是巨噬細(xì)胞被激活時(shí)產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，是在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生最早的炎癥介質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)的一些生理反應(yīng)中起著多方面的作用[23]。

表2 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.1 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖率的影響

細(xì)胞活力是反映細(xì)胞增殖及細(xì)胞相對(duì)增殖率的重要的指標(biāo)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能，它能識(shí)別和吞噬入侵機(jī)體的一些病原及對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害的物質(zhì)，引起機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]。且前人研究表明，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、纖維化肺炎及潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾病轉(zhuǎn)歸等方面巨噬細(xì)胞本身的一些功能有重要意義[25]。一些細(xì)胞炎癥因子、LPS等物質(zhì)能激活巨噬細(xì)胞，其中LPS稱為內(nèi)毒素，對(duì)單核巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的激活功能[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)沙蔥總黃酮能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖率，當(dāng)沙蔥總黃酮濃度為100.0～200.0 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著升高，濃度在12.5～50.0 μg/mL時(shí),增殖率明顯不及前者，但是當(dāng)濃度達(dá)到200.0 μg/mL時(shí)，增殖率會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，所以過低、過高濃度的黃酮類化合物都會(huì)影響細(xì)胞活力。

3.2 沙蔥總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO能力及相關(guān)炎性因子的表達(dá)和分泌的影響

在LPS等炎癥物質(zhì)的刺激下，巨噬細(xì)胞的活性增強(qiáng)，并合成和釋放大量的NO、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12、IL-6等炎癥介質(zhì)。在人體的病理過程中多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，從而保證人體的正常生理過程[27]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮、黃酮醇、查爾酮等黃酮類化合物均能在細(xì)胞水平上抑制LPS誘導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)靶基因的表達(dá)和IL-1產(chǎn)生，并抑制機(jī)體內(nèi)外的炎癥反應(yīng)[28]。急性肺損傷動(dòng)物模型的研究結(jié)果表明，用黃酮醇、黃酮對(duì)動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)后，動(dòng)物機(jī)體支氣管肺泡灌洗液中的炎癥因子蛋白含量下降，嗜中性粒細(xì)胞減少，炎癥得到緩解[29]。丹參酮類成分是白花丹參主要有效成分之一，有較好的抗炎活性，丹參酮ⅡA通過抑制炎癥因子IL-10、TNF-α以及血小板的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[30]。甘草黃酮類單體異甘草素能抑制RAW264.7細(xì)胞IL-1β和IL-6基因表達(dá)及炎癥因子的釋放[31]。在體外抗炎研究中發(fā)現(xiàn)，茼麻葉總黃酮能顯著降低巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥因子的含量，同時(shí)能顯著提高IL-10的含量[32]。用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的研究也發(fā)現(xiàn)，一定濃度的伯葉黃酮能顯著降低細(xì)胞中TNF-α、NO、IL-6的含量[33]。黃酮類化合物還能抑制LPS所引起的下游NF-κB靶基因的表達(dá)、TAK1蛋白激酶激活和一些炎癥因子的釋放[34]，說明黃酮類化合物在體外抗炎反應(yīng)中有很重要的作用。本研究結(jié)果表明，未受LPS刺激的巨噬細(xì)胞上清液中含有少量的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，當(dāng)受到LPS刺激之后，上述炎癥因子的含量顯著提高；但給予黃酮類化合物后，能顯著降低這些炎癥因子的含量。同樣，IL-10在沒有LPS刺激前的含量很低，給予黃酮類化合物后，存在不同程度的上升。所以，沙蔥總黃酮能降低LPS炎癥模型中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表達(dá)量，并提高IL-10含量。

4 結(jié) 論

沙蔥總黃酮能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖率，降低細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量以及細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表達(dá)，同時(shí)還能增加IL-10的含量以及IL-10 mRNA的表達(dá)。所以，沙蔥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞具有顯著的抗炎作用。