張 慧 郭清泉* 舒緒剛 謝 宇 譚 威 劉 迪 張亞楠

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣州510006；2.廣州天科生物科技有限公司，廣州510627； 3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州510225)

隨著人類社會(huì)的進(jìn)步，養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；图s化迅速發(fā)展，為追求高產(chǎn)，防止畜禽疾病發(fā)生，提高飼料報(bào)酬，飼料添加劑應(yīng)運(yùn)而生。它的使用可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，進(jìn)而提高養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。但飼料添加劑的安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)尤為重要，它直接關(guān)系到人類的健康。二氫楊梅(dihydromyricetin，DMY)是黃酮醇類化合物[3-4]，它的化學(xué)名稱是3，5，7，3′，4′，5′-六羥基2，3雙氫黃酮，其結(jié)構(gòu)如圖1。它具有較高的超離域度，整個(gè)分子形成一個(gè)大π鍵共軛體系，具有強(qiáng)烈的配合作用。因具有抗菌、抗腫瘤、護(hù)肝、抗氧化等多方面的生理活性，近年來DMY已作為新型飼料添加劑得到廣泛的應(yīng)用。鎳(Ni)是機(jī)體所必需的微量元素，主要作用是激活機(jī)體的各種酶，它具有獨(dú)特的協(xié)調(diào)和催化電子轉(zhuǎn)移特性，缺乏鎳可出現(xiàn)生長緩慢、生殖力減弱，但鎳的過量可導(dǎo)致心肌、腦、肺臟、肝臟和腎臟退行性變。研究發(fā)現(xiàn)DMY金屬配合物的生物活性明顯強(qiáng)于單一有效成分，并且可以同時(shí)補(bǔ)充畜禽生長必需的微量元素[5-7]，故二氫楊梅素-鎳配合物(DMY-Ni)的研究成為熱點(diǎn)，但目前有關(guān)DMY-Ni的研究大都停留在其工藝制備、抗氧化性、抑菌性等生物活性方面[8-9]，缺少有力的穩(wěn)定性及安全性方面的數(shù)據(jù)。20世紀(jì)80年代末，Nguyen等[10]首次建立細(xì)胞毒性檢測(cè)的方法，它是在一種離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測(cè)藥物抑制細(xì)胞生長和其他毒性作用的方法，其中噻唑藍(lán)(MTT)法最為常用，此方法簡單直觀，可分析不同組分及濃度對(duì)細(xì)胞的毒性。本試驗(yàn)擬以DMY和乙酸鎳為原料合成DMY-Ni，并以小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，研究DMY及DMY-Ni對(duì)體外細(xì)胞增殖的影響，旨在為安全合理將DMY-Ni用做飼料添加劑提供指導(dǎo)。

圖1 二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of DMY

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMY：西安四季生物科技有限公司，純度98%；無水乙醇、乙酸鎳、無水醋酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；蒸餾水：廣州屈臣氏蒸餾水公司；小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12：上海中喬新舟生物科技有限公司；DMEM(高糖)培養(yǎng)液、胎牛血清：美國Gibco公司；雙抗(青霉素-鏈霉素)：美國Fisher Scientific公司；胰蛋白酶：美國BioBasieUnit公司；MTT：美國Sigma公司；二甲基亞砜：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器

DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；NICOLET-380型傅里葉變換紅外光譜儀：德國Bruker公司；CO-150型INNOVA CO2培養(yǎng)箱：美國NBS公司；SpectraMax Paradigm酶標(biāo)儀：澳大利亞Molecular Devices公司；高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 DMY-Ni的合成

準(zhǔn)確稱取0.640 g(2 mmol)的DMY裝于250 mL帶有磁力攪拌子的三口圓底燒瓶中，加100 mL的無水乙醇，待加熱、攪拌完全溶解后，向該溶液中加入一定量的無水醋酸鈉調(diào)節(jié)pH約為7.5，繼續(xù)攪拌0.5 h后，加入相同物質(zhì)的量的乙酸鎳0.498g(2mmol)，在70℃的水浴下攪拌冷凝回流6 h，反應(yīng)結(jié)束后放置冷卻至室溫，減壓抽濾，用蒸餾水和無水乙醇交替反復(fù)洗滌沉淀3次，然后于40 ℃下真空干燥10 h，得黃褐色固體粉末。

1.4 DMY-Ni的表征

紫外光譜表征：將DMY和所得配合物先分別用少量二甲基亞砜溶解，然后再用大量水稀釋至試驗(yàn)所需濃度，以水為參比樣，在200～600 nm內(nèi)掃描紫外-可見吸收光譜。

紅外光譜表征：采用溴化鉀(KBr)壓片法分別對(duì)DMY和所得配合物進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.5 細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長期的小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12，用DMEM(高糖)培養(yǎng)液調(diào)整至5×104個(gè)/mL，并以100 μL/孔接種到96孔板中，邊緣加磷酸鹽緩沖液(PBS)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄去上清，用完全培養(yǎng)基將DMY與DMY-Ni分別按試驗(yàn)設(shè)定的濃度梯度配制好，每孔加入含DMY或DMY-Ni的培養(yǎng)液100 μL，并分別孵育12、24、36和48 h。試驗(yàn)設(shè)定的DMY或DMY-Ni終濃度分別為10、20、40、80和160 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組與調(diào)零組。待作用相應(yīng)時(shí)間后，棄去上清，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，放置10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處的吸光度(OD)值，重復(fù)3次，按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：

細(xì)胞增殖率(%)=(試驗(yàn)組平均OD值/ 空白對(duì)照組平均OD值)×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMY-Ni的表征

2.1.1 紫外光譜掃描

由圖2可以看到，DMY在292 nm處有強(qiáng)吸收峰，與鎳離子配合后，吸收峰的位置移到了305 nm處，與DMY相比發(fā)生了明顯的紅移，說明DMY的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，有新的產(chǎn)物生成。

圖2 DMY和DMY-Ni的紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-vis absorption spectra of DMY and DMY-Ni

2.1.2 紅外光譜掃描

由圖3可知，3 407.78 cm-1是苯環(huán)上的羥基伸縮振動(dòng)，說明生成的配合物仍存在羥基；DMY在1 642.37 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這是4位羰基產(chǎn)生的，在生成配合物時(shí)，由于4位羰基與5位羥基偶合作用，導(dǎo)致4位羰基碳氧雙鍵變?nèi)酰辗逦恢靡浦? 598.43 cm-1處，向低波數(shù)移動(dòng)了43.94 cm-1，說明羰基參與了反應(yīng)。在1 400～1 500 cm-1處苯環(huán)骨架的吸收峰位置變化不大，說明DMY和生成的配合物均存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在1 050～1 150 cm-1處醚鍵吸收峰位置基本不變，說明在生成配合物時(shí)C環(huán)醚鍵未發(fā)生開環(huán)；但在低頻指紋區(qū)中，生成的配合物與DMY相比，在651.87 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，表明DMY與鎳離子發(fā)生了作用，形成了以Ni-O鍵結(jié)合的配合物DMY-Ni。

圖3 DMY和DMY-Ni的紅外光譜圖Fig.3 IR-spectra of DMY and DMY-Ni

2.2 DMY與DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞增殖的影響

由圖4-A可以看到，在分別經(jīng)過12、24 h的作用后，隨著DMY濃度的增加，AML12細(xì)胞的存活率基本不變；在分別經(jīng)過36、48 h的作用后，AML12細(xì)胞的存活率隨著DMY濃度的增大而減小，抑制作用并不明顯。在同一濃度下，隨著DMY作用時(shí)間的增加，AML12細(xì)胞的存活率也有所下降。由圖4-B可以看到，在分別經(jīng)過12、24 h的作用后，隨著DMY-Ni濃度的增加，AML12細(xì)胞的存活率基本保持不變，這和DMY作用于AML12細(xì)胞的情況一致。而當(dāng)DMY-Ni分別作用于AML12細(xì)胞36、48 h時(shí)，在低濃度時(shí)，AML12細(xì)胞的存活率基本不變，在高濃度時(shí)，AML12細(xì)胞的存活率隨DMY-Ni濃度的增加而下降，且下降幅度較相同情況下的DMY明顯。在同一濃度不同的作用時(shí)間下，AML12細(xì)胞的存活率也是呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

圖5為DMY和DMY-Ni在作用48 h后對(duì)AML12細(xì)胞增殖的影響，可以看出當(dāng)DMY濃度在160 μg/mL時(shí)，其對(duì)AML12細(xì)胞增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用，該組AML12細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)；DMY濃度低于160 μg/mL時(shí)，AML12細(xì)胞的存活率基本不變，與空白對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)。DMY-Ni濃度為80～160 μg/mL時(shí)，其對(duì)AML12細(xì)胞表現(xiàn)出了一定的毒性作用，這2組AML12細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01或P<0.001)；DMY-Ni低于80 μg/mL時(shí)，AML12細(xì)胞的存活率基本不變，與空白對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)。通過GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，得出DMY對(duì)AML12細(xì)胞的IC50為285.10 μg/mL，DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞的IC50為222.84 μg/mL，稍低于DMY的IC50，說明配合物DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞的毒性較DMY有所增大。

3 討 論

DMY與鎳離子配合后，其紫外-可見吸收光譜發(fā)生了明顯的紅移現(xiàn)象，紅外吸收光譜在指紋區(qū)有新的特征吸收峰出現(xiàn)，是Ni—O鍵，從而證明了DMY-Ni配合物的生成。

圖4 DMY和DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of DMY and DMY-Ni on proliferation of AML12 cells

與空白對(duì)照組相比，差異性顯著表示為：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

Compared with the blank control group, the differences are significantly expressed as: *,P<0.05; **,P<0.01; ***,P<0.001.

圖5DMY和DMY-Ni作用48h后對(duì)AML12細(xì)胞增殖影響

Fig.5 Effects of DMY and DMY-Ni on proliferation of AML12 cells after treatment for 48 h

劑量是毒理學(xué)研究中最重要的概念。DMY-Ni作為飼料添加劑使用，研究其量效關(guān)系非常重要。有研究顯示化學(xué)物質(zhì)體外細(xì)胞毒性與其引起的動(dòng)物死亡率及人體死亡的血藥濃度之間都存在良好的相關(guān)性?；瘜W(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的損傷和死亡，最終可表現(xiàn)為細(xì)胞水平上的改變，由此研究體外細(xì)胞毒性可以預(yù)測(cè)體內(nèi)急性毒性。

周防震等[11]從細(xì)胞水平證明了DMY的低毒性，作用48 h時(shí)，DMY對(duì)L-02細(xì)胞的IC50為324.8 μg/mL；舒洋[12]通過MTT法檢測(cè)了DMY對(duì)2種正常人永生化肝細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示DMY對(duì)正常人肝細(xì)胞沒有明顯的抑制作用；蘇東林等[13]以受試樣品最大使用濃度、受試動(dòng)物最大灌胃容量為試驗(yàn)用量，即Wistar大鼠口服灌胃DMY 5.0 g/kg BW，結(jié)果沒有動(dòng)物死亡，解剖也未發(fā)現(xiàn)有組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地的改變，從而證明了DMY的低毒性。但對(duì)于DMY的使用，目前并沒有明確規(guī)定其安全劑量。

DMY與鎳離子結(jié)合后其抗氧化、抑菌性等生物活性方面均有加強(qiáng)，對(duì)于其安全性方面，本試驗(yàn)采用MTT法，研究得出DMY對(duì)AML12細(xì)胞的IC50為285.10 μg/mL。由于同一種藥物，作用于不同的細(xì)胞株，其耐受性也會(huì)有差異[14-15]。故本試驗(yàn)結(jié)果仍可看作與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致，即DMY具有低毒性。本試驗(yàn)中得出DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞的IC50為222.84 μg/mL，雖然DMY-Ni的IC50較DMY減小，但相差并不大，從這些結(jié)果對(duì)比來看，DMY和DMY-Ni對(duì)正常細(xì)胞確實(shí)具有低毒性。

由于DMY-Ni的IC50比DMY減小了，證明其毒性有所增加。有研究表明，DMY金屬配合物與其配體DMY相比，金屬離子與配體DMY產(chǎn)生了協(xié)同作用，其抗腫瘤活性提高[16]，這也可能是DMY-Ni對(duì)正常小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12毒性相較于其配體DMY增加的原因。

4 結(jié) 論

① 以DMY和乙酸鎳為原料，本試驗(yàn)成功合成了配合物DMY-Ni。

② DMY與DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，且隨作用時(shí)間的延長，毒性逐漸增大。

③ DMY對(duì)AML12細(xì)胞具有低毒性，DMY-Ni對(duì)AML12細(xì)胞的毒性較DMY有所增加，但也是低毒性。