王明會(huì) 劉志梅 王昊棋 官家家 胡慶美 王曉鵑

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271018)

肉雞產(chǎn)業(yè)具有較快的周轉(zhuǎn)期和較高的經(jīng)濟(jì)效益，但長期以來在育種過程對(duì)生長速率和飼料報(bào)酬的過分追求，導(dǎo)致當(dāng)前的肉雞品系生長發(fā)育速度極快[1]，脂肪沉積能力強(qiáng)，對(duì)各類應(yīng)激較為敏感[2]。應(yīng)激影響動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)，增加疾病風(fēng)險(xiǎn)[3]。因而了解應(yīng)激反應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，無論從科學(xué)角度還是從實(shí)際生產(chǎn)角度來看都至關(guān)重要[4]。有研究表明，飼養(yǎng)環(huán)境溫度每增加1 ℃，雞的體脂率增加0.8%，腹脂率增加1.6%[5]。此外，氧化應(yīng)激也干擾機(jī)體正常的脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致肌纖維內(nèi)的脂肪沉積量增加[6]。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(FATP1)可以作為脂肪沉積的候選基因參與脂肪酸的攝取和甘油三酯(TG)的沉積[7]。FATP1受到核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的調(diào)控[8]。組織肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)是脂肪酸β氧化過程中的限速酶[9]。所以本試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了脂肪代謝相關(guān)組織——肝臟、腹脂、胸肌和腿肌的PPARα、FATP1 mRNA表達(dá)量和CPT1含量，旨在研究糖皮質(zhì)激素——地塞米松(DEX)引發(fā)的應(yīng)激和飼糧脂肪水平影響家禽脂肪異位沉積的機(jī)制，為探索應(yīng)激反應(yīng)的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制和建立家禽應(yīng)激的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選取1日齡愛拔益加(AA)雄性肉仔雞300只，飼喂至22日齡時(shí)選取體重相近的200只，隨機(jī)分成2個(gè)處理：低脂飼糧(LFD，代謝能12.7 MJ/kg，粗脂肪6.60%)處理；高脂飼糧(HFD，代謝能12.7 MJ/kg，粗脂肪9.50%)處理。每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。35日齡時(shí)每個(gè)處理下設(shè)2個(gè)子處理：以2.0 mg/kg BW皮下注射DEX(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)；皮下注射等體積的生理鹽水(對(duì)照)。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，自由采食和飲水。連續(xù)注射3 d。預(yù)試期為7 d(22～29日齡)，正試期為9 d(30～38日齡)。正試期結(jié)束后采集樣品，采樣前空腹12 h。每個(gè)子處理取10只雞(2只/重復(fù))，翅靜脈采血，分離血漿后冷凍保存待測(cè)。采集血液后剖殺，剝離胸肌、腿肌、腹脂、肝臟并稱重，取部分胸大肌、臀股二頭肌、腹脂、肝臟組織樣品分裝后放入液氮中速凍，隨后置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

根據(jù)NRC(1994)推薦的肉雞微量元素和維生素需要量，同時(shí)結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)配制基礎(chǔ)飼糧。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

29～34日齡記錄體重和采食量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

剖殺后測(cè)定各組織器官重量，計(jì)算組織器官比重，計(jì)算公式如下：

組織器官比重=100×組織器官重量/體重。

利用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)法測(cè)定血液和組織中TG含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

利用肝素-鎂比濁法測(cè)定血液中極低密度脂蛋白(VLDL)含量，具體操作參照Griffin等[10]的步驟，測(cè)定結(jié)果為450 nm處的吸光度值。

利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定各組織中的CPT1含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

采用Trizol法提取各組織總RNA。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cNDA(試劑盒購自Roche公司)，之后采用SYBR Green熒光染料法(試劑盒購自Roche公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(ABI公司的Q5型實(shí)時(shí)定量PCR儀)。各基因引物分別為GR(GenBank登錄號(hào)DQ227738)：上游5′-CATGAACCTCGAAGCTCGCAAGA-3′，下游5′-ACCTCCAGCAGTGACACCAG-3′；PPARα(GenBank登錄號(hào)AF163809)：上游5′-AGACACCCTTTCACCAGCATCC-3′，下游5′-AACCCTTACAACCTTCACAAGCA-3′；FATP1(GenBank登錄號(hào)DQ352834)：上游5′-TCAGGAGATGTGTTGGTGATGGAT-3′，下游5′-CGTCTGGTTGAGGATGTGACTC-3′。目的基因的mRNA表達(dá)量用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：VA 8 000 IU，VD33 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg，VB14 mg，VB23.6 mg，VB310 mg，VB540 mg，VB64 mg，VB120.02 mg，生物素 biotin 0.15 mg，葉酸 folic acid 1.0 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg，Zn (as zinc sulfate) 75 mg，I (as potassium iodide) 0.40 mg，Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

2)營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)全部采用SAS 8.0軟件ANOVA程序進(jìn)行單因素以及雙因素方差分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧脂肪水平對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可以看出，不同脂肪水平的飼糧對(duì)平均日增重、平均日采食量、料重比無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧脂肪水平對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響(29～34日齡)

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞組織發(fā)育的影響

由表3可以看出，2種飼糧飼喂條件下，與對(duì)照子處理相比，糖皮質(zhì)激素均顯著降低了肉雞的體重和腿肌重(P<0.05)，顯著提高了肝臟重和肝臟比重(P<0.05)，胸肌重以及腿肌比重沒有顯著變化(P>0.05)。LFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素顯著提高了腹脂比重和胸肌比重(P<0.05)，腹脂重有增加的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)；而在HFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素對(duì)腹脂比重和胸肌比重?zé)o顯著影響(P>0.05)，腹脂重有降低的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。

表3 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞組織器官發(fā)育的影響

續(xù)表3項(xiàng)目 Items飼糧 Diet對(duì)照 Control糖皮質(zhì)激素 GlucocorticoidP值 P-value糖皮質(zhì)激素 Glucocorticoid飼糧×糖皮質(zhì)激素 Diet×glucocorticoid肝臟比重 Liver proportion/%LFD1.80±0.05b2.36±0.10a<0.000 1HFD1.87±0.06b2.37±0.09a0.000 20.699 0腹脂比重 Abdominal fat proportion/%LFD1.62±0.08b2.05±0.14a0.015 3HFD1.69±0.081.96±0.150.131 60.028 8胸肌比重 Breast muscle proportion/%LFD9.12±0.22b9.70±0.15a0.039 2HFD9.23±0.179.68±0.290.188 40.253 2腿肌比重 Thigh muscle proportion/%LFD8.33±0.228.16±0.160.545 8HFD8.29±0.128.58±0.350.435 00.106 7

2.3 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

由表4可以看出，LFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素顯著提高了胸肌、腿肌的TG含量(P<0.05)，肝臟的TG含量有增加的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)，對(duì)腹脂的TG含量無顯著影響(P>0.05)；HFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素對(duì)胸肌、肝臟、腹脂TG含量無顯著影響(P>0.05)，腿肌TG含量有增加的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。無論飼喂LFD還是HFD條件下，糖皮質(zhì)激素對(duì)血液中VLDL含量均無顯著影響(P>0.05)，但均顯著提高了血液的TG含量(P<0.05)。

表4 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

2.4 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響

由表5可以看出，LFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素對(duì)肝臟、胸肌和腿肌的CPT1含量無顯著影響(P>0.05)，但顯著提高了腹脂的CPT1含量(P<0.05)；HFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致肝臟和胸肌的CPT1含量顯著下降(P<0.05)，而腹脂和腿肌的CPT1含量顯著上升(P<0.05)。

表5 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞組織器官CPT1含量的影響

由表6可以看出，LFD飼喂條件下，糖皮質(zhì)激素顯著降低肝臟GR、PPARα和FATP1的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，胸肌FATP1 mRNA表達(dá)量有升高的趨勢(shì)(0.05

表6 糖皮質(zhì)激素和飼糧脂肪水平對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

續(xù)表6項(xiàng)目 Items飼糧 Diet對(duì)照 Control糖皮質(zhì)激素 GlucocorticoidP值 P-value糖皮質(zhì)激素 Glucocorticoid飼糧×糖皮質(zhì)激素 Diet×glucocorticoid胸肌Breast muscle糖皮質(zhì)激素受體 LFD1.00±0.101.11±0.150.549 3GRHFD1.02±0.101.40±0.260.211 1過氧化物酶體增殖物激活受體α LFD1.00±0.141.18±0.260.555 0PPARαHFD1.02±0.161.38±0.210.197 6脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 LFD1.00±0.112.12±0.610.077 3FATP1HFD1.38±0.14b2.56±0.40a0.023 70.044 30.940 60.897 6腿肌Thigh muscle糖皮質(zhì)激素受體 LFD1.00±0.160.59±0.100.054 7GRHFD1.41±0.401.12±0.060.512 8過氧化物酶體增殖物激活受體α LFD1.00±0.230.53±0.090.108 5PPARαHFD1.04±0.200.70±0.080.184 0脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 LFD1.00±0.200.69±0.190.305 1FATP1HFD0.71±0.300.94±0.230.576 70.764 80.303 90.266 9

3 討 論

應(yīng)激發(fā)生時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺軸激活釋放的糖皮質(zhì)激素被用于維持體內(nèi)能量平衡和代謝穩(wěn)定[11]。此時(shí)，機(jī)體對(duì)能量的需要量增加，能量重新分配[12]，脂肪酸向骨骼肌等非脂肪組織轉(zhuǎn)移，從而發(fā)生脂肪異位沉積現(xiàn)象[13]。肉雞上的研究表明，糖皮質(zhì)激素升高導(dǎo)致脂肪酸從頭合成能力增強(qiáng)，骨骼肌內(nèi)脂肪異位沉積量增加[14]。本實(shí)驗(yàn)室近年來在肉雞上的研究表明，按2.0 mg/kg BW注射一種人工合成的糖皮質(zhì)激素3～7 d，能夠成功誘導(dǎo)肉雞的糖脂代謝發(fā)生改變[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，等能量的HFD、LFD飼喂肉雞不會(huì)影響生產(chǎn)性能，但不管飼喂何種飼糧，糖皮質(zhì)激素處理均降低了肉雞的體重、抑制了腿肌的發(fā)育、提高了肝臟比重、并提高了血液TG含量，這提示糖皮質(zhì)激素調(diào)控脂肪代謝，使機(jī)體能量重新分配。

飼喂LFD時(shí)，糖皮質(zhì)激素處理顯著提高了腹脂比重及胸肌、腿肌的TG含量，肝臟的TG含量有提高的趨勢(shì)，而飼喂HFD時(shí)糖皮質(zhì)激素并無上述效應(yīng)，說明在脂肪相對(duì)缺乏時(shí)，糖皮質(zhì)激素促進(jìn)了脂肪的沉積，包括在腹部皮下的沉積以及在肌肉和肝臟的異位沉積，而在脂肪相對(duì)充足時(shí)能夠緩解糖皮質(zhì)激素的這一調(diào)控作用。這進(jìn)一步證實(shí)了應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)能量的需要增加，以及糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)體能量分配的調(diào)控作用。已有研究表明，糖皮質(zhì)激素上調(diào)肝臟脂類合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、蘋果酸酶(ME)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)的表達(dá)，下調(diào)載脂蛋白的表達(dá)[16]，說明糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致肝臟脂肪從頭合成增多，但是肝臟中大量合成的TG不能完全與載脂蛋白結(jié)合裝配成VLDL，這與本試驗(yàn)中肝臟TG含量增多而血液VLDL含量無顯著變化的結(jié)果相一致。

CPT1是脂肪酸β氧化過程中的限速酶[17]。HFD飼喂后，糖皮質(zhì)激素提高了腹脂和腿肌的CPT1含量，降低了肝臟和胸肌的CPT1含量，說明HFD飼喂肉雞時(shí)應(yīng)激促進(jìn)了腹脂和腿肌的脂肪酸β氧化而抑制了肝臟和胸肌的脂肪酸β氧化。作者推測(cè)，LFD飼喂的肉雞受到應(yīng)激時(shí)，由于飼糧中脂肪含量較低，機(jī)體無法快速啟動(dòng)組織的脂肪酸氧化機(jī)制提供能量，當(dāng)HFD飼喂的肉雞受到應(yīng)激時(shí)，腹脂和腿肌可以通過激活組織CPT1，促進(jìn)脂肪酸的氧化利用，從而緩解應(yīng)激造成的脂肪沉積現(xiàn)象。飼喂HFD時(shí)糖皮質(zhì)激素促進(jìn)腿肌的CPT1合成而抑制胸肌的CPT1合成，之前的研究也發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素促進(jìn)腿肌而抑制胸肌的CPT1 mRNA表達(dá)[14]，這可能與腿肌是氧化型紅肌而胸肌是酵解型白肌有關(guān)[13]。

FATP1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的溶質(zhì)攜帶家族成員，也是最為重要的一種載脂蛋白[18]。研究表明，F(xiàn)ATP1能夠特異性結(jié)合脂肪酸(特別是長鏈和超長鏈脂肪酸)并運(yùn)輸它們通過細(xì)胞膜[19]。研究認(rèn)為，F(xiàn)ATP1在機(jī)體的糖脂代謝方面發(fā)揮著重要作用，甚至將FATP1作為治療過度肥胖和二型糖尿病的一個(gè)重要靶點(diǎn)[20]。在哺乳動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATP1能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的酯化沉積，而敲除FATP1基因之后可以減少肌肉組織中TG的沉積[21]，即使飼喂HFD也未發(fā)生脂肪沉積和胰島素抵抗[22]。雞上的研究也表明，F(xiàn)ATP1與肉雞屠體性狀有相關(guān)性[23]。FATP1受到核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——PPAR的調(diào)控[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體脂肪沉積量增加時(shí)，PPARα及其調(diào)控的靶基因表達(dá)量均升高[24]。PPARα能夠通過脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)影響脂肪酸的攝取和酯化沉積[23]，PPARα基因沉默時(shí)FATP和長鏈脂肪酸的攝取均減少[24]。雞PPARα的組織特異性分布與哺乳動(dòng)物相似[25]，PPAR基因可以作為家禽脂肪性狀的候選基因。Meng等[26]和解相林等[25]的研究中均提出，PPARα是影響肉雞脂肪代謝的主效基因之一。Cui等[27]對(duì)2種脂肪沉積能力不同的肉雞品系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PPAR信號(hào)通路參與了脂肪的沉積。所以本試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了脂肪合成的位點(diǎn)肝臟、脂肪儲(chǔ)存的位點(diǎn)腹脂、脂肪的利用位點(diǎn)胸肌和腿肌中PPARα和FATP1 mRNA表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素處理導(dǎo)致GR、PPARα、FATP1 mRNA表達(dá)量在腹脂和胸肌中大體呈上調(diào)趨勢(shì)，而在肝臟和腿肌中大體呈下降趨勢(shì)，這說明糖皮質(zhì)激素對(duì)脂肪代謝的調(diào)控具有組織特異性。但糖皮質(zhì)激素處理對(duì)各組織中GR、PPARα、FATP1 mRNA表達(dá)量的影響規(guī)律基本一致，這進(jìn)一步表明糖皮質(zhì)激素可能通過GR-PPARα通路調(diào)控了FATP1基因的表達(dá)。

4 結(jié) 論

① 糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致肉雞體內(nèi)的能量發(fā)生重分配，促進(jìn)了脂肪在腹部皮下的沉積以及在肌肉和肝臟的異位沉積，而抑制了肌肉發(fā)育和體重增長。

② 糖皮質(zhì)激素對(duì)GR、PPARα、FATP1 mRNA表達(dá)的調(diào)控具有組織特異性，糖皮質(zhì)激素可能通過GR-PPARα-FATP1調(diào)控肉雞的脂肪沉積。

③ 飼糧脂肪水平能夠影響糖皮質(zhì)激素的調(diào)控效應(yīng)，HFD可能通過激活腹脂和腿肌的CPT1，促進(jìn)脂肪酸的氧化利用，從而緩解糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的脂肪沉積現(xiàn)象。