楊柳　趙爽　殷雪艷　劉彪　羅萬麟

摘 要：通過生物大數(shù)據(jù)和檢測工具，對(duì)煙草半胱氨酸蛋白酶的序列特征、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，煙草半胱氨酸蛋白酶均具有信號(hào)肽，且含有組織蛋白酶前肽抑制劑結(jié)構(gòu)域和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶；經(jīng)初次亞細(xì)胞定位，NtCP-1，NtCP-2，NtCP-3和NtCP-4定位于細(xì)胞質(zhì)，NtCP-5定位于液泡；二級(jí)結(jié)構(gòu)中，NtCP-1，NtCP-2和NtCP-5的α-螺旋比例最大，而NtCP-3和NtCP-4以無規(guī)則卷曲比例最大；三級(jí)結(jié)構(gòu)N-端聚集較為疏松，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，C-端的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主。

關(guān)鍵詞：煙草；半胱氨酸蛋白酶；結(jié)構(gòu)；特性

中圖分類號(hào)：S517 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.001

Characterization and Structure Analysis of Tobacco Cysteine Protease

YANG Liu， ZHAO Shuang， YIN Xueyan， LIU Biao， LUO Wanlin

（Liangshan Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China）

Abstract： Tobacco cysteine protease sequence characteristics， subcellular localization， secondary structure and tertiary structure were analyzed with large biological data and detection tools. The results showed that tobacco cysteine protease had a signal peptide， and contained a cathepsin propeptide inhibitor domain and a papain family cysteine protease. The initial subcellular localization， NtCP-1， NtCP-2， NtCP-3 and NtCP-4 were located in cytoplasm， and NtCP-5 was located in the vacuole. In the secondary structure， NtCP-1， NtCP-2 and NtCP-5 had the largest proportion of alpha helix， while NtCP-3 and NtCP-4 had the largest specific gravity in the random coil. The tertiary structure had looser N-terminal aggregation， its secondary structure was mainly α-helix， and the C-terminal secondary structure was mainly β-sheet.

Key words： tobacco； cysteine protease； structure； characteristics

半胱氨酸蛋白酶具有降解和儲(chǔ)存蛋白[1-2]、抵抗生物或非生物脅迫[3-6]、參與細(xì)胞的衰老和程序性的死亡等作用[7-8]，該蛋白酶一般在細(xì)胞質(zhì)中生成前體性蛋白，再通過自身信號(hào)肽，轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如細(xì)胞壁和液泡等[9-10]，一般半胱氨酸的蛋白酶具有相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域[11]，位于葉綠體的半胱氨酸蛋白酶降解核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）[12]。

烤后煙葉顏色是煙草收購標(biāo)準(zhǔn)之一[13]，主要受鮮煙葉色素含量和烤中煙葉變黃的影響，即受細(xì)胞衰老和色素的影響，而半胱氨酸蛋白酶與植物的細(xì)胞衰老和色素降解有關(guān)[14]。本研究對(duì)煙葉半胱氨酸蛋白酶的特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為其進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 煙草半胱氨酸蛋白酶家族成員的獲取

運(yùn)用NCBI[15]數(shù)據(jù)庫，檢索并提取煙草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列，其登錄號(hào)分別為ABW71226.1，BAA96501.1，ACB70409.1，AAW7866 0.1和ADV41672.1，并分別對(duì)其進(jìn)行命名NtCP-1，NtCP-2，NtCP-3，NtCP-4和NtCP-5[16]。

1.2 方 法

采用結(jié)構(gòu)域分析工具SMART[17]，對(duì)煙草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸數(shù)、信號(hào)肽位置、結(jié)構(gòu)域成分以及結(jié)構(gòu)域分布進(jìn)行分析；運(yùn)用TargetP 1.1在線服務(wù)[18]，獲取煙草半胱氨酸蛋白酶的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；采用NPSA-PRABI工具[19]，測定煙草半胱氨酸蛋白酶的β-轉(zhuǎn)角、β-折疊、α-螺旋和無規(guī)則卷曲，分析序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用SWISS-MODEL工具[20]，根據(jù)同源相似原理，構(gòu)建煙草半胱氨酸蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草半胱氨酸蛋白酶的序列特征

通過分析蛋白酶的氨基酸序列，有利于了解其功能特性，因此，采用SMART對(duì)NtCP進(jìn)行序列特征的分析，結(jié)果如表1所示。NtCP的氨基酸數(shù)量無明顯波動(dòng)，介于349～361，其中，NtCP-1和NtCP-2相同（360），NtCP-3和NtCP-4相同（361），NtCP-5的氨基酸數(shù)最?。?49）；NtCP各成員都含有信號(hào)肽，均位于N-端；均含有組織蛋白酶前肽抑制劑結(jié)構(gòu)域（Inhibitor_I29），但存在的位置有所不同，其中，NtCP-1和NtCP-2的所在位置相對(duì)靠后，處于61～121，而NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5的所在位置較為靠前，處于38～99；均含有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶（Pept_C1），其位置分布規(guī)律同Inhibitor_I29較為相似。

2.2 煙草半胱氨酸蛋白酶的亞細(xì)胞定位和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

為明確NtCP位于煙草中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，詳情如表2所示。NtCP-1、NtCP-3和NtCP-4可能定位于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡或類囊體結(jié)構(gòu)中，其中NtCP-1和NtCP-4定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，而NtCP-3定位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性最大；NtCP-2可能定位于細(xì)胞質(zhì)、液泡、類囊體或細(xì)胞外，但定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可能性較大；NtCP-5可能定位于液泡、類囊體或細(xì)胞外，可能主要位于液泡內(nèi)。為進(jìn)一步探究NtCP二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對(duì)蛋白序列中的β-轉(zhuǎn)角、β-折疊、α-螺旋和無規(guī)則卷曲分布及其成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。β-轉(zhuǎn)角于序列內(nèi)的分布較為分散，其在NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5序列內(nèi)所占比例依次為11.67%，11.94%，10.25%，10.25%和10.03%；β-折疊一般存在于第50位氨基酸序列之后，其于各序列中所占比例依次為20.00%，18.89%，20.22%，19.11%和14.90%；α-螺旋主要分布在氨基酸序列的0～100和150～250，所占比重依次為38.06%，39.17%，30.47%，31.86%和39.83%；無規(guī)則卷曲無明顯分布規(guī)律，所占比重依次為30.28%，30.00%，39.06%，38.78%和35.24%。

2.3 煙草半胱氨酸蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用HHBlits和Blast的同源比對(duì)法，以NtCP的氨基酸序列為依據(jù)，檢索SWISS-MODEL的三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，經(jīng)篩選，以蛋白原的晶體結(jié)構(gòu)，以及2.70 Amb a 11和2.05 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一種主要的豚草花粉過敏原）的晶體結(jié)構(gòu)為模板，其序列分別1cs8.1，5egw.1，45ef4.1，構(gòu)建NtCP的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。NtCP-1和NtCP-2依據(jù)蛋白原的晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建其相關(guān)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2-A），NtCP-1和NtCP-2氨基酸序列的覆蓋率均為0.82%，且含有的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋數(shù)依次為21，27，11個(gè)；NtCP-3和NtCP-4依據(jù)2.70 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一種主要的豚草花粉過敏原）的晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建其相關(guān)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2-B），其序列的覆蓋率均為0.92%，NtCP-3二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)依次為17，35，12個(gè)，NtCP-4的依次為18，37，12個(gè)；NtCP-5依據(jù)的晶體結(jié)構(gòu)為2.05 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一種主要的豚草花粉過敏原），構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2-C），為單體，且具有4組GOL配體，序列的整體覆蓋率為0.89%，其二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)依次為18，35，14個(gè)。NtCP的三級(jí)結(jié)構(gòu)均以N-端聚集較為疏松，且N-端的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，C-端的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)煙草半胱氨酸蛋白酶的序列特征分析可知，NtCP均含有信號(hào)肽，即屬于分泌蛋白，且經(jīng)過初次亞細(xì)胞定位，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均位于細(xì)胞質(zhì)，NtCP-5位于液泡；二次定位之后，存在亞細(xì)胞的位置發(fā)生變化，NtCP-1和NtCP-2定位于液泡，NtCP-3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和類囊體，NtCP-4定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而NtCP-5被分泌于細(xì)胞外。因此，推斷NtCP的功能具有多樣性[12]。煙草半胱氨酸蛋白酶均含有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別為組織蛋白酶前肽抑制劑結(jié)構(gòu)域和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶，說明該蛋白具有較高的保守性，且具有2種蛋白的功能[21]；NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5的α-螺旋比例均最大，有利于保證三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而NtCP-3和NtCP-4以無規(guī)則卷曲的比例最大，不利于三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[16]；N-端的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，C-端的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，表明NtCP的功能域可能位于中間和C-端序列。

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