惠怡然，楊珍珍，李岳衡，高 盼，許培榮，范天黎

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州人民醫(yī)院藥劑科 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

食管癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，在我國(guó)主要以食管鱗癌為主(占90%以上)[1]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是臨床食管癌治療的一線藥物，作用原理是通過促進(jìn)微管聚合阻止細(xì)胞有絲分裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]；但在化療過程中經(jīng)常出現(xiàn)腫瘤耐藥現(xiàn)象，是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[3]。腫瘤對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，也常常會(huì)對(duì)作用機(jī)制不同的其他藥物產(chǎn)生耐藥，即多藥耐藥[4]。在這個(gè)過程中往往伴隨著耐藥蛋白以及Bcl-2家族蛋白的變化。體外建立腫瘤耐藥細(xì)胞株的方法主要有低劑量持續(xù)誘導(dǎo)法和大劑量間歇沖擊法，相比而言，低劑量持續(xù)誘導(dǎo)過程繁瑣，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用大劑量間歇沖擊結(jié)合時(shí)間遞增的方法，建立食管鱗癌PTX耐藥細(xì)胞株EC1/PTX，并對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1材料人EC1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，RPMI 1640培養(yǎng)基、凝膠電泳試劑盒為索萊寶公司產(chǎn)品，胰蛋白酶消化液、CCK-8試劑為碧云天公司產(chǎn)品，基質(zhì)膠為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，Transwell小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品，小鼠抗人β-actin單抗購自武漢三鷹公司，兔抗人P-gp、Bcl-2、Bax單抗購自Abcam公司，PTX購自海南中化聯(lián)合制藥有限公司，多柔比星(ADM)購自浙江海正藥業(yè)，五氟尿嘧啶(5-FU)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，順鉑(CDDP)購自山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將EC1細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好、密度達(dá)到90%以上的情況下傳代，用PBS洗去殘留培養(yǎng)基后，用胰蛋白酶消化，之后用培養(yǎng)基終止，按比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)至后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3耐藥細(xì)胞株EC1/PTX的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC1細(xì)胞，以100倍半數(shù)抑制濃度(IC50)為誘導(dǎo)劑量用PTX誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h，然后撤去含藥培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，加入常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液以去除死細(xì)胞。15～20 d后存活的細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行消化處理，傳代3次后重復(fù)上述操作，此階段共作用3次。之后延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間為4 h，重復(fù)7次。總計(jì)加藥作用10次，誘導(dǎo)過程共歷時(shí)8個(gè)月，最后得到耐藥細(xì)胞株EC1/PTX。

1.4耐藥細(xì)胞株EC1/PTX的生物學(xué)特性

1.4.1 細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察EC1和EC1/PTX的形態(tài)。

1.4.2 生長(zhǎng)曲線及倍增時(shí)間 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC1或EC1/PTX細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按照1.0×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到24孔板中，每種細(xì)胞接種21孔，每天3孔。每天于相同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)細(xì)胞，取3孔平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。根據(jù) Patterson 公式計(jì)算倍增時(shí)間。倍增時(shí)間=Tlg2/lg(Nt/N0)，其中N0為第一次計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)th后的細(xì)胞數(shù)，T為細(xì)胞數(shù)從N0增至Nt的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 耐藥指數(shù)及交叉耐藥性 制備EC1或EC1/PTX單細(xì)胞懸液，按照3×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板中，24 h后吸出培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度的PTX、ADM、5-FU和CDDP的培養(yǎng)基100 μL，共設(shè)9個(gè)梯度濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(5-FU組培養(yǎng)72 h)，每孔加入10 μL CCK-8溶液放置2 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度值，計(jì)算IC50及耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.4.4 細(xì)胞遷移及侵襲能力 ①侵襲實(shí)驗(yàn)：將無血清RPMI 1640培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按4∶1比例混勻后，取40 μL涂布到Transwell小室上室面，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h。與此同時(shí)制備EC1或EC1/PTX單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，取200 μL加入Transwell小室上室中，再在24孔板中加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。48 h后取出小室放入甲醇中固定30 min，之后用結(jié)晶紫染色，漂洗，晾干，顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②遷移實(shí)驗(yàn)：不需要在Transwell小室涂布基質(zhì)膠，其他步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 克隆形成能力 制備EC1或EC1/PTX單細(xì)胞懸液，以1 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱1周，觀察克隆形成情況。用PBS漂洗2次，加入1 mL甲醇固定30 min，PBS漂洗3次，再加入結(jié)晶紫染色液30 min，PBS洗去多余結(jié)晶紫?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.6 細(xì)胞周期及凋亡 ①細(xì)胞周期：制備EC1或EC1/PTX單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇4 ℃固定過夜，第2天加入預(yù)冷的PBS 1 mL重懸細(xì)胞，離心后移去上清。沉淀中先加入100 μL RNaseA混勻，37 ℃水浴30 min，再加入500 μL PI染色液混勻， 24 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②細(xì)胞凋亡：制備EC1或EC1/PTX單細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，24 h貼壁后，加入100 nmol 的PTX孵育48 h。收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，先加入500 μL的Binding buffer重懸，再加入5 μL的Annexin-FITC混勻，加入10 μL的PI染色液混勻，室溫下避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5EC1/PTX細(xì)胞中P-gp、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)收集EC1/PTX或EC1細(xì)胞，PBS 清洗 2遍，加入裂解液置于冰上裂解 30 min，低溫離心機(jī) 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，收集上清，BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白體積加入上樣緩沖液，置于100 ℃沸水中約5 min，通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，設(shè)置電壓為90 V，約30 min跑完濃縮膠，再調(diào)節(jié)電壓為120 V，繼續(xù)電泳至跑完分離膠，之后設(shè)置電壓為100 V，轉(zhuǎn)膜1 h。室溫封閉2 h，加一抗(P-gp、Bax按 1∶1 000 稀釋，Bcl-2按 1∶2 000 稀釋，β-actin 按 1∶5 000 稀釋) 后4 ℃過夜，加二抗37 ℃孵育2 h。按照儀器要求步驟曝光。使用 Image J 軟件分析，以目的條帶和 β-actin 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。EC1和EC1/PTX細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EC1/PTX的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察親本細(xì)胞EC1貼壁生長(zhǎng)，排列均勻，形狀規(guī)則。PTX誘導(dǎo)24 h后EC1細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生明顯改變，細(xì)胞變圓變??；敏感細(xì)胞不斷死亡，需每天更換培養(yǎng)基，最后僅存少數(shù)貼壁細(xì)胞；撤藥10 d后細(xì)胞開始增殖，20 d左右可以進(jìn)行消化傳代，最終形成的耐藥細(xì)胞EC1/PTX形態(tài)變長(zhǎng)，并常呈聚團(tuán)生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1)。

A：PTX作用前；B：PTX作用24 h；C：撤藥12～15 d；D：撤藥20～22 d；E：EC1/PTX圖1 倒置顯微鏡下觀察PTX作用前后EC1細(xì)胞形態(tài)變化

(×200)

2.2EC1/PTX的生長(zhǎng)曲線及倍增時(shí)間生長(zhǎng)曲線見圖2。根據(jù)生長(zhǎng)曲線， EC1和EC1/PTX細(xì)胞倍增時(shí)間分別為(28.43±0.38)、(33.96±0.96) h，EC1/PTX增殖速度明顯減慢(t=9.306,P<0.001)。

圖2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3不同藥物對(duì)EC1/PTX細(xì)胞的IC50及其耐藥指數(shù)IC50結(jié)果見表1。與親本細(xì)胞EC1相比， EC1/PTX對(duì)PTX有較高的耐藥性，對(duì)ADM、5-FU具有一定的交叉耐藥性，耐藥指數(shù)分別為12.82、3.92、5.04。

表1 IC50測(cè)定結(jié)果 mg/L

2.4EC1/PTX細(xì)胞的遷移、侵襲和克隆形成能力結(jié)果見圖3和表2。EC1/PTX的遷移及侵襲能力均強(qiáng)于親本細(xì)胞EC1，克隆形成能力弱于EC1。

2.5EC1/PTX細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率結(jié)果見

表3、4。與親本細(xì)胞EC1相比，EC1/PTX的G0/G1、S期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少；100 nmol的PTX作用48 h后凋亡率顯著降低。

圖3 EC1和EC1/PTX細(xì)胞平板克隆形成情況表2 EC1/PTX與EC1細(xì)胞遷移、侵襲和克隆形成能力的比較

細(xì)胞n遷移細(xì)胞數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)克隆形成率/%EC131 973±2171 025±26183.53±2.76EC1/PTX32 813±831 777±16149.97±4.97t6.2694.23010.222P0.0030.013<0.001

表3 EC1/PTX與EC1細(xì)胞周期的比較 %

表4 EC1/PTX與EC1細(xì)胞凋亡率的比較 %

2.6EC1/PTX細(xì)胞P-gp、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果(圖4、表5)顯示，與EC1細(xì)胞比較，EC1/PTX中耐藥蛋白P-gp和抗凋亡蛋白Bcl-2相對(duì)表達(dá)量較高，促凋亡蛋白Bax的相對(duì)表達(dá)量較低。

圖4 EC1和EC1/PTX細(xì)胞中不同蛋白的表達(dá)表5 EC1/PTX與EC1細(xì)胞不同蛋白表達(dá)的比較

細(xì)胞nP-gpBaxBcl-2EC130.55±0.122.06±0.590.56±0.13EC1/PTX32.96±0.440.88±0.231.82±0.68t9.2013.2423.172P<0.001 0.0320.034

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用大劑量間歇沖擊結(jié)合時(shí)間遞增的方法成功誘導(dǎo)出食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株EC1/PTX。與親本細(xì)胞EC1相比，EC1/PTX生長(zhǎng)速度減慢，倍增時(shí)間延長(zhǎng)；細(xì)胞周期重新分布，G0/G1期、S 期分布增多，G2/M期分布減少。有研究[5]認(rèn)為細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性與其自身的周期分布有密切關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞主要分布于對(duì)化療藥物相對(duì)不敏感的時(shí)期如G0/G1期時(shí)，則表現(xiàn)出耐藥性。相同時(shí)間、相同劑量的藥物作用下，親本細(xì)胞EC1出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，凋亡率顯著高于EC1/PTX細(xì)胞，再次證明EC1/PTX細(xì)胞對(duì)PTX產(chǎn)生耐藥。EC1/PTX不僅對(duì)PTX耐藥，而且對(duì)從未接觸過的其他化療藥物ADM、5-FU及CDDP也發(fā)生一定程度的交叉耐藥。EC1/PTX細(xì)胞體外增殖能力、克隆形成能力均明顯低于親本細(xì)胞EC1，這種現(xiàn)象可能與細(xì)胞長(zhǎng)期被藥物沖擊作用有關(guān)，并且與耐藥細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)的情況相符合，細(xì)胞增殖時(shí)間越長(zhǎng)其對(duì)化療藥物越不敏感。

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥最主要的機(jī)制是細(xì)胞表面膜蛋白介導(dǎo)的藥物外排增加[6]，其中ABC蛋白超家族又是促進(jìn)藥物外排的一個(gè)重要機(jī)制，目前研究最多的是三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B1(ATP-binding cassette B1, ABCB1)，又稱P-gp[7]。另外，細(xì)胞凋亡通路受到抑制也在腫瘤耐藥過程中發(fā)揮著重要作用。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員，分別發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，兩者共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)量升高、Bax蛋白表達(dá)量降低時(shí)，將抑制細(xì)胞凋亡，反之將促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-9]。因此我們采用Western blot實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)EC1/PTX細(xì)胞中P-gp和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化情況，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞EC1相比，EC1/PTX中P-gp表達(dá)上升，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)量上升的同時(shí)Bax蛋白表達(dá)量下降。

以上研究結(jié)果表明EC1/PTX產(chǎn)生了穩(wěn)定的多藥耐藥表型，其耐藥機(jī)制可能與P-gp、Bcl-2蛋白高表達(dá)有關(guān)。此細(xì)胞耐藥模型將有助于我們更深入地研究腫瘤細(xì)胞耐藥獲得過程中相關(guān)基因及其信號(hào)通路的變化。