趙 媛， 云 梅， 楊國柱， 段曉明

(1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海西寧 810016； 2.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧 810016

對葉紅景天(Rhodiolasubopposita)為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)植物，是多年生草本植物，也是我國特有的植物，主要分布在青海省、東北地區(qū)、甘肅省、新疆維吾爾自治區(qū)、四川省、西藏自治區(qū)、云南省、貴州省等地[1]，野生資源有限。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天不僅有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射、抗菌等顯著功能，還有延緩機體衰老、防止老年疾病等功能[2]。內(nèi)生菌為能定植在植物組織間隙或細胞內(nèi)部，并且能與宿主植物建立起共棲、互惠共生、共養(yǎng)等一系列關(guān)系的微生物[3]。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，植物內(nèi)生菌構(gòu)筑了宿主植物的健康屏障。內(nèi)生菌生物防治植物病害的主要機制包括分泌抗菌物質(zhì)、競爭生態(tài)位及誘導植物抗性等[4]，還可以通過促進植物生長達到抗病效果。因此，研究植物內(nèi)生菌，尋找具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，是研發(fā)新型無公害農(nóng)藥的重要途徑，前景廣闊。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對葉紅景天的根、莖、葉及根際土壤采自青海省西寧市大通縣大阪山，經(jīng)青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院張得鈞教授鑒定為景天科紅景天屬對葉紅景天。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 L，pH值自然。

細菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水 1 L，pH值自然。

放線菌培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.00 g、KNO31.00 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂18.00 g、蒸餾水1.00 L，pH值自然。

馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L，pH值自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、甘油10.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水1.0 L，pH值自然。

碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水1.0 L，pH值自然。

氮源發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油10.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水1.0 L，pH值為7.3。

1.3 內(nèi)生菌分離

將采集的對葉紅景天新鮮根、莖、葉用自來水沖洗多次，然后在無菌條件下將根、莖切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊，葉剪成1 cm×1 cm的小塊，在75%乙醇中潤洗1 min后用無菌水漂洗3次，再用0.1%次氯酸進行消毒。根、葉消毒 5 min，莖消毒8 min，再用無菌水沖洗3次，然后放在已滅菌的濾紙片上，待水吸干后分別接種在加有鏈霉素的PDA培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基及高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng) 3～4 d，待切口邊緣長出菌絲后，取單菌落轉(zhuǎn)到新的PDA 培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)3次后編號并接種到試管斜面培養(yǎng) 4～7 d，放入冰箱中4 ℃保存[5-6]。試驗中設(shè)立對照：吸取消毒后最后1次沖洗材料的無菌水，涂布于各分離平板上培養(yǎng)。若無雜菌長出，表明表面消毒徹底，分離到的是內(nèi)生菌[7]?？梢愿鶕?jù)培養(yǎng)基平板上長出菌落的形態(tài)、顏色、大小等挑取不同的單菌落純化后保存[8]。

1.4 抗病菌株篩選

采用平板對峙法：用平板劃線法將內(nèi)生菌和病原菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，用滅過菌的直徑為6 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣切取同樣大小的菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，在PDA培養(yǎng)基平板距中心25 mm處用打孔器切去同樣大小的菌餅，并將內(nèi)生菌用無菌水稀釋后用移液槍接在孔內(nèi)，每個處理重復3次。27 ℃培養(yǎng)3 d后測量抑菌帶的寬度，抑菌帶直徑大于等于10 mm用“+++”表示，抑菌帶直徑大于等于5 mm，小于10 mm用“++”表示，抑菌帶直徑小于5 mm用“+”表示，沒有抑菌活性用“-”表示[9]。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1 種子液制備 選取抑菌活性最好的菌株G5接種于PDA固體培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；用接種環(huán)挑取單菌落，接入裝有50 mL PDB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，于25 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.5.2 搖瓶培養(yǎng) 取2 mL種子液接入100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 3 d，將發(fā)酵液在10 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用抑菌圈法進行抑菌效果檢測，培養(yǎng)3 d后，觀察抑菌效果[10]。

1.5.3 最佳碳源的篩選 碳源發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，碳源分別設(shè)為1.0%葡萄糖、1.0%乳糖、1.0%果糖、1.0%甘油、1.0%可溶性淀粉、1.0%蔗糖[10]，以碳源發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，接入10% G5菌株種子液，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d；將發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min，收集上清液，在PDA培養(yǎng)基平板上涂布上清液，并用滅過菌的直徑為6 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣切取同樣大小的菌餅于PDA培養(yǎng)基平板中央，測定發(fā)酵上清液的抑菌效果。

1.5.4 最佳氮源的篩選 氮源發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，氮源分別設(shè)為2.0%蛋白胨、2.0%尿素、2.0%豆粕、2.0%硫酸銨、2.0%大豆蛋白胨、2.0%牛肉膏、2.0%酵母膏[10]；以氮源發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，其他條件相同，抑菌效果測定方法同“1.5.3”節(jié)。

1.5.5 磷酸鹽對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 采用篩選出的最佳碳源和氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無K2HPO4)中分別加入KH2PO4、K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸鹽，設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%等3個濃度梯度，以不加K2HPO4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照[10]，基礎(chǔ)發(fā)酵條件培養(yǎng)后，測定發(fā)酵上清液的抑菌效果。

1.5.6 金屬離子對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 采用篩選出的碳源、氮源、磷酸鹽，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無MgSO4·7H2O)中分別加入FeCl3、CuSO4、NaCl、ZnSO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、KNO3等溶液，設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%等3個濃度梯度，以不加MgSO4·7H2O的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照[10]，基礎(chǔ)發(fā)酵條件培養(yǎng)后，測定發(fā)酵上清液的抑菌效果。

1.5.7 優(yōu)化驗證 以篩選得到的最佳碳源、最佳氮源、最適磷酸鹽、最適金屬離子作為優(yōu)化培養(yǎng)基。以5%接種量分別接種到優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在25 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心 15 min，收集上清液，測定發(fā)酵上清液的抑菌效果。試驗中以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，測定其抑菌性。

1.6 G5菌株的形態(tài)學鑒定

1.6.1 G5菌株菌落形態(tài)觀察 菌落形態(tài)觀察采用點接法[11]。蘸取少量孢子，在PDA培養(yǎng)基平板中央接植1點，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察G5菌落顏色、大小、質(zhì)地、邊緣、生長速度等特性。

1.6.2 G5菌株顯微鏡觀察 對G5菌株進行顯微鏡觀察，首先對G5菌株進行革蘭氏染色，然后分別在低倍顯微鏡及高倍顯微鏡下進行觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌株的分離

通過對對葉紅景天新鮮根、莖、葉的菌種分離純化，依據(jù)菌落生長形態(tài)特征，從對葉紅景天中初步篩選出24株內(nèi)生菌，其中真菌5株，占20.8%(P1～P5)，細菌12株，占50.0%(T1～T12)，放線菌7株，占29.2%(G1～G7)。

2.2 對葉紅景天抗病內(nèi)生菌的篩選

如表1所示，通過平板對峙法得出，24株菌株中有12株菌株對蠶豆莢枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄鐮刀菌Ⅰ、茄鐮刀菌Ⅱ均有不同程度的抑菌活性，其中放線菌G5、真菌P1對茄鐮刀菌Ⅰ有強抑菌活性；放線菌G1、真菌P2、細菌T11對菜豆黑斑病病原菌有強抑菌活性；細菌T3對茄鐮刀菌Ⅱ有強抑菌性，具體見圖1。選用抑菌活性最好的放線菌G5菌株進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

表1 對葉紅景天內(nèi)生菌抗病菌株篩選

2.3 內(nèi)生菌培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 不同碳源對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 試驗檢測了葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、乳糖、果糖、蔗糖等6種不同碳源對內(nèi)生菌抑菌活性的影響。由圖2可知，以乳糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基抑菌效果最好，病原菌菌落直徑為12.25 mm，小于對照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的病原菌直徑(21.75 mm)，其次是可溶性淀粉，而葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油等作為碳源時內(nèi)生菌的抑菌活性較差。因此，選用乳糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

2.3.2 不同氮源對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 試驗檢測了牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、豆粕、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素等作為氮源時內(nèi)生菌的抑菌活性。由圖3可知，以蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基抑菌效果最好，病原菌菌落直徑為11.40 mm，小于對照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的病原菌菌落直徑(40.00 mm)，其次是大豆蛋白胨、豆粕，而牛肉膏、硫酸銨等作為氮源時內(nèi)生菌的抑菌活性較差。因此，選用蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.3.3 不同磷酸鹽對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 不同磷酸鹽的不同濃度對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響如圖4所示，KH2PO4、K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2HPO4·2H2O 等對抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有不同程度的促進或抑制作用，而Na2HPO4·12H2O的3個不同濃度對抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有較高的促進作用，且以濃度為 0.30%時最為明顯。因此，選擇0.30%Na2HPO4·12H2O為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳磷酸鹽。

2.3.4 不同金屬離子對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 不同金屬離子的不同濃度對G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響如圖5所示，F(xiàn)eCl3、CuSO4、NaCl、ZnSO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、KNO3等對抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有不同程度的促進或抑制作用，而NaCl的3個不同濃度對抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有較高的促進作用，且以濃度為0.30%時最為明顯。因此，選擇0.30%NaCl為發(fā)酵培養(yǎng)基的金屬離子溶液。

2.4 內(nèi)生菌培養(yǎng)條件優(yōu)化驗證

試驗測定了優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)下G5菌株的抑菌效果。由圖6可知，優(yōu)化培養(yǎng)條件下G5菌株的抑菌效果較好，培養(yǎng)至第7天時其抑菌活性提高了30.06%。

2.5 G5菌株形態(tài)學鑒定

在顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，G5菌株為短桿狀，大小為2.81 μm，呈革蘭氏陰性(圖7)。G5菌株菌落形態(tài)觀察結(jié)果見表3。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌的分離及其天然產(chǎn)物的研究已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點領(lǐng)域。與不計其數(shù)的植物附生菌相比，內(nèi)生菌似乎吸引了更多的注意力。主要原因為植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物， 其中不少物質(zhì)都具有抑菌活性，在自然界中具有重要的生態(tài)學作用，因而引起了人們的廣泛關(guān)注并取得了較大進展[12-14]。因此，利用我國的植物內(nèi)生菌資源來篩選抗菌和殺菌活性物質(zhì)，促進新型生物農(nóng)藥的開發(fā)和創(chuàng)新具有十分重要的意義[15]。

表3 G5菌落形態(tài)觀察結(jié)果

對葉紅景天是青海地區(qū)高海拔珍貴藥用植物，具有抗菌消炎的藥理活性。本研究從青海高山地區(qū)對葉紅景天中分離出24株內(nèi)生菌，其中有12株具有抑菌活性，進一步證明了內(nèi)生菌具有與宿主相似的藥理活性。下一步可對抗病內(nèi)生菌的有效成分進行分離提取，試圖找出使其具有抗病性的某種物質(zhì)。

目前，對對葉葉紅景天具有抗病抑菌作用的報道較少，因此對于對葉紅景天的更多有效抑制成分有待進一步研究，為對葉紅景天應用于臨床抗菌治療提供充足的科學依據(jù)。