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冠狀動脈因狹窄、阻塞或其功能異常，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病被統(tǒng)稱為冠心病(coronary heart disease，CHD)[1]。它是由多種危險因素和遺傳基因相互作用而導(dǎo)致的慢性復(fù)雜性疾病。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和狹窄、心肌梗死后重塑、細(xì)胞凋亡等過程，它通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、脂質(zhì)條紋早期病變和動脈粥樣硬化等誘發(fā)CHD的發(fā)生[2]。確定CHD的易感基因及其在維吾爾族、漢族間的差異，可從分子水平對CHD的發(fā)病機(jī)制有進(jìn)一步的認(rèn)識，從而更好地控制病因及改善預(yù)后。

新疆是中國心血管病的高發(fā)地區(qū)，CHD的發(fā)病規(guī)律因民族、性別及地域等因素的不同也不盡相同[3]。由于女性CHD在預(yù)后、壽命、生存質(zhì)量等方面有別于男性，且其是威脅女性健康和生命的主要疾病，近年來更多的研究關(guān)注于對女性CHD的發(fā)病及預(yù)后情況。本研究中將TGF-β1基因作為主要研究指標(biāo)，在基因水平上了解TGF-β1基因多態(tài)性在維吾爾族、漢族女性CHD分布情況，探究該人群CHD發(fā)病率的差異性是否與此相關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院就診的明確診斷為CHD的維吾爾族及漢族女性病人作為研究對象，嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)共收集180例女性冠心病病人，其中維吾爾族70例(38.9%)，年齡(59.70±8.21)歲；漢族冠心病110例(61.1%)，年齡(60.09±6.13)歲。同時選擇年齡、性別和民族相匹配的健康女性100名(健康對照組)，其中維吾爾族40名(36.36%)，年齡(60.03±6.61)歲；漢族60名(63.64%)，年齡(58.40±6.41)歲。入選的研究對象均知情同意。制定納入病例一般情況及中醫(yī)證候類型調(diào)查表，并記錄所有研究對象一般資料(年齡、性別、民族、診斷等)。研究對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法 對所有研究對象抽取血樣，進(jìn)行DNA提取，統(tǒng)一進(jìn)行基因檢測。受試者知情同意，空腹采集靜脈血4 mL，k2-EDTA抗凝。3 000 r/min離心分離血漿和紅細(xì)胞，有形細(xì)胞層于1周內(nèi)行單個核細(xì)胞基因組DNA的提取，提取后的DNA置-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩；蚨鄳B(tài)性檢測技術(shù)(SNP檢測技術(shù))：①DNA樣本取1 μL，運(yùn)用1% 瓊脂糖電泳，對其進(jìn)行質(zhì)量檢查和濃度估計，然后根據(jù)其估計的濃度，將樣本稀釋至5 ng/μL～10 ng/μL。②進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：對PCR引物(rs1800469、rs2241715、rs480345、rs8110090、rs8105161、rs2241716、rs1800470、rs1800471)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后取3 μL PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化，用ExoI去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的DNTP，37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min，純化好后進(jìn)行延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物(其PCR擴(kuò)增引物序列詳見表1)。③ SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)，對延伸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)，并進(jìn)行PCR循環(huán)程序(預(yù)變性：96 ℃ 1 min，變性：96 ℃ 10 s，退火：52 ℃ 5 s，延伸：60 ℃ 30 s，共30個循環(huán))。④延伸產(chǎn)物純化，取1 μL延伸產(chǎn)物，加9 μL上樣HIDI，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀。⑤延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀，將各組分混勻，95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。SNP位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

表1 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計

圖1 SNP位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析；不滿足正態(tài)分布的資料用中位數(shù)(四分為數(shù)區(qū)間)表示，采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 對180例維吾爾族、漢族女性冠心病及100名健康對照組TGF-β1基因的rs1800469、rs2241715、rs480345、rs8110090、rs8105161、rs2241716、rs1800470、rs18004718個位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行吻合度分析，頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明納入病例具有群體代表性。

2.2 女性冠心病及健康女性在TGF-β1基因表達(dá)比較 對女性冠心病與健康女性TGF-β1的8個基因位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行比較，rs8105161、rs2241716兩位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，rs1800469、rs2241715、rs4803455、rs8110090、rs1800470、rs1800471位點(diǎn)的基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果提示rs8105161、rs2241716位點(diǎn)基因可能與女性CHD發(fā)病有關(guān)。詳見表2。

表2 女性冠心病和健康女性的基因型分布 例(%)

2.3 維吾爾族、漢族女性冠心病在TGF-β1基因表達(dá)上的比較 TGF-β1基因檢測的8個位點(diǎn)中，rs8110090、rs8105161、rs1800471三個位點(diǎn)的基因型分布頻率在維吾爾族、漢族女性CHD間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他5個位點(diǎn)的基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因維吾爾族、漢族遺傳基因存在種族差異，考慮該差異可能與維吾爾族、漢族對CHD的易感性不同有關(guān)。詳見表3。

表3 維吾爾族、漢族女性冠心病組間的基因差異 例(%)

3 討 論

冠心病是心血管疾病中最常見疾病，根據(jù)2016年美國最新發(fā)表的心血管及腦卒中相關(guān)數(shù)據(jù)[3]，CHD發(fā)病率及死亡率仍然呈現(xiàn)上升態(tài)勢，心源性死亡是女性目前首要的死亡原因，其中CHD患病率為6.1%，與男性相比低2.2%，其中45歲～65歲女性的缺血性心臟病、微血管病變和非梗阻性CHD發(fā)病率較高，65歲以上高齡婦女，梗阻性心臟病患病率明顯增加。由于特殊的地理環(huán)境、風(fēng)俗習(xí)慣以及種族遺傳因素，新疆是我國心血管病的高發(fā)地區(qū)[4]。前期相關(guān)研究提示，維吾爾族、漢族女性CHD的發(fā)病特點(diǎn)、危險因素、遺傳基因等方面都具有一定的差異性。CHD是由多種危險因素和遺傳基因相互作用而導(dǎo)致的慢性復(fù)雜性疾病。TGF-β1是由血小板、骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞組成的一種細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、參與炎癥和免疫等多種生物學(xué)活性[5]。TGF-β1參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和狹窄、心肌梗死后重塑、細(xì)胞凋亡等過程，它通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、脂質(zhì)條紋早期病變和動脈粥樣硬化，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增生和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，在血管損傷部位促使血管重塑、管腔狹窄等，從而導(dǎo)致CHD的發(fā)生[2]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能緩解損傷反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)修復(fù)、抑制粥樣斑塊的形成[6]，認(rèn)為TGF-β1可能是冠狀動脈的保護(hù)因子。TGF-β1基因定位于染色體19q13，存在多個SNP位點(diǎn)[7]。不同人群的TGF-β1基因多態(tài)性呈現(xiàn)不同的TGF-β1生物學(xué)效應(yīng)，從而可能會影響該人群不同個體對相關(guān)疾病的易感性。近年來，國內(nèi)外多項研究對不同人群的TGF-β1基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)疾病進(jìn)行了關(guān)聯(lián)探討。韋常麗等[8]研究TGF-β1基因第1外顯子+869T/C及+915G/C多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示攜帶+869T/C基因C等位基因的原發(fā)性高血壓病人血壓水平明顯高于不攜帶者，故認(rèn)為其+869T/C基因與原發(fā)性高血壓有關(guān)，而+915G/C基因多態(tài)性與該疾病無明顯關(guān)聯(lián)。董建華等[9]研究TGF-β1T869C基因多態(tài)性與慢性腎衰竭的相關(guān)性，結(jié)果顯示該基因多態(tài)性與慢性腎衰竭的進(jìn)展有顯著相關(guān)性，其中C等位基因和CC基因型對慢性腎衰竭進(jìn)展具有遺傳易感性。鄒邵敏等[10]對340例CHD和271例非CHD病例TGF-β1基因的rs1800469多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分型及分析， CHD組與對照組的基因分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但T等位基因明顯增加個體患CHD的發(fā)病風(fēng)險(OR=1.49)。

本研究就TGF-β1基因的rs1800469、rs2241715、rs4803455、rs8110090、rs8105161、rs2241716、rs1800470、rs1800471八個基因位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行分析，女性CHD組與健康對照組比較，rs8105161、rs2241716兩位點(diǎn)基因型的分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他位點(diǎn)基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示rs8105161、rs2241716位點(diǎn)基因可能與女性CHD的發(fā)病有關(guān)。維吾爾族、漢族女性冠心病rs8110090、rs8105161、rs1800471三個位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，預(yù)測TGF-β1該位點(diǎn)的基因多態(tài)性對維吾爾族、漢族女性CHD的遺傳易感性存在差異，考慮該差異與維吾爾族、漢族間遺傳基因?qū)HD的易感性不同有關(guān)，但不同易感性對CHD發(fā)病的影響尚需進(jìn)一步研究。