楊 峰，周宏超，許信剛，張為民，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于動脈炎病毒屬，豬感染后造成以嚴(yán)重的繁殖障礙(妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎或畸形胎和公豬精液質(zhì)量下降等)與呼吸障礙(咳嗽、氣喘、呼吸困難等)為主要臨床癥狀的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，因發(fā)病豬的耳朵發(fā)紺呈藍(lán)紫色又稱豬藍(lán)耳病，我國將豬高致病性豬藍(lán)耳病列為一類動物疫病[1]。PRRSV在豬群傳播2個月～3個月就可導(dǎo)致95%以上的豬為血清學(xué)陽性[2]，世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬企業(yè)均認(rèn)為豬藍(lán)耳病嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)殖集約化，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了極大的影響[3]。豬感染PRRSV后，常伴隨繼發(fā)感染，臨床癥狀復(fù)雜，且當(dāng)前PRRSV毒株種類多，加之不同毒株疫苗的使用，給臨床診斷豬是否感染PRRSV造成了較大的困難[4-5]。常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法是目前實(shí)驗(yàn)室檢測PRRSV的常用方法，然而在靈敏度和病毒含量測定等方面尚存在一些不足[6]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)憑借其簡單的操作，較高的靈敏度、良好的重復(fù)性和量化的結(jié)果以及較短的檢測時(shí)耗等優(yōu)點(diǎn)，逐漸在實(shí)驗(yàn)室的檢測中得到了廣泛應(yīng)用，尤其是費(fèi)用相對較低的熒光染料法實(shí)時(shí)定量PCR[7-10]。本研究根據(jù)NCBI中登錄的PRRSV的ORF7基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立基于Eva Green的 real-time PCR檢測方法，以期為PRRSV的臨床診斷提供一種特異、靈敏、快速及量化的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株及病料 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α，康維世紀(jì)生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.2 待檢病料 27份病料為陜西省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場臨床疑似PRRSV感染發(fā)病豬的肺臟和脾臟，每頭豬的各種組織混合為1份病料。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker DL 2 000和2×TaqMaster Mix，康維世紀(jì)生物科技公司產(chǎn)品；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技公司產(chǎn)品；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEAST-T1克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，全式金生物公司產(chǎn)品；2×Eva Green Premix，ABM 生物科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參考NCBI中登錄的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF7基因序列(KU950375.1、KP771739.1等)，分析保守序列，用Primer 5設(shè)計(jì)一對特異性引物。所設(shè)計(jì)的熒光定量特異性上、下游引物序列分別為PRRSV-F：5′-GAAGCCCCATTTCCCTCT-3′，PRRSV-R：5′-CTTATCCTCCCTGAATCTGACA-3′，擴(kuò)增片段長度為144 bp。引物由西安擎科澤西生物公司合成，稀釋至濃度為10 μmol/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PRRSV RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取保存的病毒液200 μL，加1 mL Trizol試劑，使用Trizol法提RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA置-20℃存儲或進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增 50 μL反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix和模板分別為25 μL和6 μL，上、下游引物均為4 μL，雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 25 s，56℃ 20 s，72℃ 20 s，循環(huán)30次；72℃ 10 min。

1.2.4 real-time PCR陽性質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)模板制備 按照膠回收試劑盒回收1.2.3擴(kuò)增的目的片段，并將其按照pEAST-T1克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒菌。重組質(zhì)粒菌經(jīng)常規(guī)PCR鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒菌中的陽性質(zhì)粒按照試劑盒的操作步驟提取，進(jìn)行測序分析。用超微量光譜分析儀測定陽性質(zhì)粒濃度，按照以下公式將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，然后進(jìn)行10-1～10-9的梯度稀釋。稀釋后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，置-20℃保存?zhèn)溆?。拷貝?shù)(copies/μL)=C×NA/MW，其中C為陽性質(zhì)粒測定的濃度，單位ng/μL，NA取值為6.02×1023copies/mol，MW為平均分子質(zhì)量，單位Dolton。

1.2.5 real-time PCR擴(kuò)增 10 μL反應(yīng)體系：2×Eva Green Premix、標(biāo)準(zhǔn)模板、上游和下游引物分別為5、1、0.3、0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃ 10 min：95℃ 3 s，60℃ 30 s，采集熒光信號，35次循環(huán)。

1.2.6 real-time PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 選取濃度稀釋10-4～10-8的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增。結(jié)果以real-time PCR儀自帶軟件分析繪制擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

1.2.7 real-time PCR特異性試驗(yàn) 用建立的real-time PCR方法分別檢測PEDV、CSFV、PCV2、PRV的cDNA或者DNA，驗(yàn)證建立的real-time PCR方法的特異性。

1.2.8 real-time PCR靈敏性試驗(yàn) 選取濃度稀釋了10-6～10-10的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，雙蒸水為陰性對照模板，real-time PCR方法擴(kuò)增。選取濃度稀釋了10-6～10-9的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，雙蒸水為陰性對照模板，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增。通過比較2種方法可以檢測到陽性結(jié)果的最低濃度，以此得出靈敏程度。

1.2.9 real-time PCR重復(fù)性試驗(yàn) 分別以同一批次104～106copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板和不同批次104～106copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，用雙蒸水作為陰性對照模板，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.10 臨床樣本的檢測 取疑似PRRSV感染的病料，加適量PBS研磨，將研磨液凍融3次后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA做待測樣本，以標(biāo)準(zhǔn)模板做陽性對照模板，以雙蒸水為陰性對照模板，用所建立的real-time PCR方法檢測，然后將real-time PCR方法檢測為陽性的樣品進(jìn)行常規(guī)RT-PCR方法檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)粒常規(guī)PCR鑒定

將菌液用熒光定量特異性引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，結(jié)果為144 bp目的片段(圖1)。將鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，通過BLAST比對，結(jié)果同源性達(dá)99%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性質(zhì)粒常規(guī)PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of positive plasmid; 2.Negative control

圖1陽性質(zhì)粒常規(guī)PCR鑒定

Fig.1 The conventional PCR identification of positive plasmid

2.2 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)模板的制備

用超微量光譜分析儀測定提取質(zhì)粒的濃度為280.2 ng/μL，OD260/OD280值為1.872，計(jì)算得拷貝數(shù)為6.276×1010copies/μL，將其稀釋至濃度分別為6.276×109、6.276×108、6.276×107、6.276×106、6.276×105、6.276×104、6.276×103、6.276×102、6.276×101、6.276×100copies/μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 real-time PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線見圖2，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，其熔解曲線見圖4。在6.276×102copies/μL 至 6.276×106copies/μL的濃度區(qū)間內(nèi)，所得拷貝數(shù)(x)與Ct值(y)的線性方程為y=-3.164x+34.635，斜率為-3.164，截距為34.635，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999，顯示了良好的線性關(guān)系。熔解曲線峰型單一，無雜峰，熔解溫度一致，Tm=83℃。

1～5. 6.276×106copies/μL～6.276×102copies/μL 5個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的real-time PCR擴(kuò)增曲線；NC.陰性對照

1-5.real-time PCR amplification curves of 6.276×106copies/μL to 6.276×105copies/μL diluted standard template,respectively;NC.Negative control

圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Fig.2 The amplification curves of real-time PCR

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

2.4 real-time PCR特異性試驗(yàn)

分別以PEDV、CSFV、PRV和PCV2的cDNA或者DNA為反應(yīng)模板，用建立的real-time PCR方法擴(kuò)增，結(jié)果表明只有PRRSV有熒光信號(圖5)，說明所建立的real-time PCR方法特異性好。

2.5 real-time PCR靈敏性試驗(yàn)

以6.276×104copies/μL～6.276×100copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，進(jìn)行real-time PCR方法擴(kuò)增。以 6.276×104copies/μL～6.276×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板作為反應(yīng)模板，進(jìn)行常規(guī)PCR方法擴(kuò)增。結(jié)果表明，real-time PCR方法檢出限為6.276×101copies/μL(圖6)，常規(guī)PCR方法檢出限為6.276×103copies/μL(圖7)，說明建立的real-time PCR檢測方法與常規(guī)RT-PCR相比靈敏100倍。

2.6 real-time PCR重復(fù)性試驗(yàn)

以6.276×106、6.276×106、6.276×104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，每個模板做3個重復(fù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(表1)，每隔1周做1次，每次做3個重復(fù)，計(jì)算平均值，做3次，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)(表2)。結(jié)果顯示，建立的real-time PCR方法的變異系數(shù)在1%以下，其重復(fù)性表現(xiàn)優(yōu)異。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

1～5. 6.276×104copies/μL～6.276×100copies/μL 5個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的real-time PCR擴(kuò)增曲線；NC.陰性對照

1-5.real-time PCR amplification curves of 6.276×104copies/μL to 6.276×100copies/μL diluted standard template,respectively;NC.Negative control

圖6實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏性試驗(yàn)

Fig.6 Sensitivity test of real-time PCR

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4. 6.276×104copies/μL～6.276×101copies/μL 4個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的常規(guī)PCR產(chǎn)物；NC.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-4.The PCR products of 6.276×104copies/μL to 6.276×101copies/μL diluted standard template; NC.Negative control

圖7 常規(guī)PCR靈敏性試驗(yàn)

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR組間重復(fù)試驗(yàn)

2.7 檢測方法的初步應(yīng)用

對疑似PRRSV感染的27份臨床組織或病料用常規(guī)RT-PCR方法和建立的real-time PCR方法分別進(jìn)行檢測。結(jié)果用常規(guī)RT-PCR方法檢出21份陽性，real-time PCR方法檢測出24份陽性(包括常規(guī)RT-PCR方法檢出的21份陽性在內(nèi))，real-time PCR 方法比常規(guī)RT-PCR方法多檢出3份。

3 討論

我國自1995年發(fā)現(xiàn)豬藍(lán)耳病后，到目前在全國大部分區(qū)域均見有報(bào)道，隨著PRRSV毒株的變異和基因型分布的差異，以及疫苗的使用，臨床上僅根據(jù)發(fā)病癥狀和病理變化診斷豬藍(lán)耳病已變得相對比較困難，因此，借助實(shí)驗(yàn)室檢測手段對早期感染和隱性帶毒者高效、快速的檢出，可以為豬藍(lán)耳防控與凈化提供一定的幫助[11]。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷PRRSV的方法主要有血清學(xué)試驗(yàn)診斷和分子生物學(xué)診斷。血清學(xué)試驗(yàn)一般用作抗體水平的檢測；分子生物學(xué)診斷包括常規(guī)RT-PCR、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)、原位雜交技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。其中用熒光標(biāo)記方法檢測特異性產(chǎn)物的real-time PCR技術(shù)，因其靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、耗時(shí)短、過程封閉、操作簡單、成本相對較低等眾多優(yōu)點(diǎn)，逐漸在病原體檢測、目的基因表達(dá)量、疫苗質(zhì)量控制等方面得到廣泛的使用[12]。

由于熒光染料能夠被嵌入到任何脫氧核糖核酸的雙鏈間，所以real-time PCR熒光染料法的引物在設(shè)計(jì)時(shí)要認(rèn)真考慮長度、退火溫度、保守性、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等方面的問題，尤其是其中的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)問題，其關(guān)系到定量的準(zhǔn)確性[13]。在試驗(yàn)時(shí)，還要注意做好防污染工作，盡管試驗(yàn)操作比較簡單，但操作中的污染如氣溶膠的污染會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；在制作標(biāo)準(zhǔn)模板時(shí)，要使陽性質(zhì)粒完全混合均勻，以此保證標(biāo)準(zhǔn)模板的濃度梯度正確性。以上方面考慮的越周全，得到的結(jié)果越穩(wěn)定，越可靠。Eva Green作為飽和熒光染料，沒有SYBR Green等非飽和染料的缺點(diǎn)—“染料重排”，制作的熔解曲線分辨率相對較高，而且可以在擴(kuò)增過程當(dāng)中及時(shí)的從DNA雙鏈中釋放出來，從而降低了對PCR擴(kuò)增過程的影響，因此使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料準(zhǔn)確性高[14-15]。

在我國，目前流行的PRRSV毒株的基因型主要為北美型[16]，在PRRSV的9個開放閱讀框中，ORF7最為保守，因此ORF7常被作為PCR、ELISA等檢測方法中主要的檢測目標(biāo)[17-19]。本研究根據(jù)NCBI上登錄的PRRSV的ORF7基因，設(shè)計(jì)了1對擴(kuò)增的目的片段為144 bp的特異性引物，構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板，使用Eva Green作為信號報(bào)告熒光，建立PRRSV real-time PCR的檢測方法。結(jié)果表明，該檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，熔解曲線峰單一；特異性強(qiáng)，只能檢測出PRRSV，最低檢測拷貝數(shù)為6.276×101copies/μL，與常規(guī)RT-PCR相比靈敏100倍；重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)在1%之下，重復(fù)性良好；用建立的real-time PCR方法檢測27份懷疑PRRSV感染的樣本，結(jié)果比常規(guī)RT-PCR的檢測結(jié)果高出3份陽性；整個real-time PCR擴(kuò)增過程只需45 min，時(shí)間過程短。

綜上所述，本研究建立的PRRSV real-time PCR檢測方法，具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，而且耗時(shí)短，可用于臨床檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染，對豬藍(lán)耳病的防控提供一定的幫助。