王小敏，楊鈺昆，張民

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西晉中 030619）（2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）（3.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

大蒜作為傳統(tǒng)的藥食兩用植物其抑菌活性已被廣泛認(rèn)可，然而大蒜刺激性和難聞的氣味限制了其消費(fèi)和利用。將新鮮大蒜切片后浸泡于低濃度乙醇水溶液中，于室溫下避光保存10個(gè)月或者20個(gè)月，過濾后得到的浸提液經(jīng)減壓低溫濃縮即得到市售的老蒜提取物[1]。老蒜提取物是一種特殊的大蒜產(chǎn)品，具有安全、低刺激性的特點(diǎn)。老蒜提取物在其制備過程中，生蒜中原有的不穩(wěn)定的化合物，通過酶催化或者自然反應(yīng)產(chǎn)生了獨(dú)特的對(duì)人體有益的有機(jī)硫化物以及生物堿，且大蒜的刺激性和臭味也得到改善[2]。

老蒜提取物對(duì)一些疾病如：糖尿病、老年癡呆癥、動(dòng)脈粥樣硬化、血管冠狀鈣化、內(nèi)皮功能異常、抗癌藥物引起的心臟毒性和細(xì)胞凋亡、心臟病、癌癥、高血壓、高血脂以及衰老[3,4]的治療或預(yù)防有積極地作用，但關(guān)于老蒜提取物抑菌活性研究較少。有文獻(xiàn)報(bào)道稱λ-谷氨酰半胱氨酸是大蒜中含硫化合物的前體物質(zhì)，經(jīng)過水解氧化可以轉(zhuǎn)化為蒜氨酸[5]。在老蒜提取物的制作過程中，蒜氨酸逐漸損失形成硫代亞磺酸酯，硫代亞磺酸酯不穩(wěn)定逐漸轉(zhuǎn)化為二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物等具有二硫鍵的化合物，這些具有二硫鍵的化合物是大蒜中主要的抑菌活性物質(zhì)[6,7]。課題組前期已經(jīng)對(duì)兩種自制老蒜提取物的抑菌活性以及可能的抑菌活性成分做了研究分析，發(fā)現(xiàn)老蒜提取物石油醚部位含有多種具有二硫鍵的化合物以及有機(jī)酸和酚類物質(zhì)使其對(duì)多種細(xì)菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌活性[8]，但兩種自制老蒜提取物石油醚部位的抑菌機(jī)理尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)以課題組自制的兩種老蒜提取物為原料采用石油醚萃取，萃取液揮干溶劑得到老蒜提取物石油醚部位，以大腸桿菌為試驗(yàn)菌株，通過激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏等實(shí)驗(yàn)，研究老蒜提取物石油醚部位對(duì)大腸桿菌的抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 原料

按實(shí)驗(yàn)室前期獲得的方法制備兩種老蒜提取物樣品，AGE-1：將普通白皮大蒜切片后于室溫下在10%乙醇水溶液中浸泡 90 d，過濾得到浸提液，浸提液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后即得；AGE-2：將大蒜切片后于室溫下在蒸餾水中浸泡20 d，過濾得到浸提液，浸提液 40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后即得[8]。取 AGE-1、AGE-2加水溶解后分別采用石油醚（60 ℃～90 ℃）進(jìn)行液液萃取，萃取兩次，合并兩次萃取液進(jìn)行濃縮，濃縮液在水浴鍋上揮干殘留溶劑，得到AGE-1和AGE-2的石油醚部位。AGE-1和AGE-2的石油醚部位分別溶解于少量二甲基亞砜，取試管加定量的蒸餾水，在漩渦振蕩器中一邊震蕩一邊用移液器逐滴加入已經(jīng)溶解于二甲基亞砜的樣品，配制成樣品的分散液，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要以蒸餾水為溶劑將樣品稀釋成不同濃度的分散液。

供試菌株：大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 25922），由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

分析天平，JD1000-2，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；酶標(biāo)儀，Multiskan FC，美國(guó)Thermo公司；生化培養(yǎng)箱，SPX-250，上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠；往復(fù)式雙門雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器，SPF-1112，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋，DY2009(X)-032-00，上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠；分光光度計(jì)，TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電導(dǎo)率儀，DDS-307，北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司；激光共聚焦顯微鏡，C1 plus，日本Nikon公司；掃描電子顯微鏡，SU1510，日本Hitachi High公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最低抑菌濃度的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定石油醚部位對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）[9]。分別取AGE-1和AGE-2的石油醚部位配制成濃度為20 mg/mL的分散液，采用倍比稀釋法稀釋為一系列濃度。取無(wú)菌96孔板，第一行1～10孔加10 μL系列濃度的樣品，第11和12孔不加樣品作為生長(zhǎng)對(duì)照，1～12孔加100 μL的105CFU/mL大腸桿菌菌懸液，平行三行。第四行 1～10孔加100 μL肉湯培養(yǎng)液作為空白，蓋上96孔板蓋，將加樣后的96孔板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm的OD值。以小孔內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)被完全抑制的最低樣品濃度為該樣品的MIC。

1.3.2 石油醚部位對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

大腸桿菌活化后，接種于液體肉湯培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，稀釋為105CFU/mL的菌懸液，取50 mL稀釋后的菌懸液與AGE-1和AGE-2的石油醚部位分散液分別混合，使AGE-1和AGE-2的石油醚部位的終濃度分別為其最低抑菌濃度，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，另外以無(wú)菌水代替樣品做空白對(duì)照。每培養(yǎng)兩小時(shí)取樣，采用分光光度計(jì)在 600 nm測(cè)菌液的OD值[10]。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏

通過培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的測(cè)定分析微生物細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏。取50 mL稀釋為105CFU/mL的菌懸液與AGE-1和AGE-2的石油醚部位分散液分別混合，使AGE-1和AGE-2的石油醚部位的終濃度分別為其最低抑菌濃度，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，另外以無(wú)菌水代替樣品做空白對(duì)照。培養(yǎng)0、3、6、9、12、18、24、30、36、42、48 h取樣，采用分光光度計(jì)在260 nm測(cè)定菌液的OD值，該值可以代表細(xì)胞內(nèi)DNA/RNA的泄漏程度由此反映出細(xì)胞膜的受損情況[11]。

1.3.4 培養(yǎng)液電導(dǎo)率的測(cè)定

取50 mL稀釋為105CFU/mL的菌懸液與AGE-1和AGE-2的石油醚部位分散液分別混合，使AGE-1和 AGE-2的石油醚部位的終濃度分別為其最低抑菌濃度，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，另外以無(wú)菌水代替樣品做空白對(duì)照。培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率[12]。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡研究石油醚部位對(duì)大腸桿菌的影響

為了研究?jī)煞N自制老蒜提取物石油醚部位對(duì)大腸桿菌細(xì)胞通透性和細(xì)胞凋亡情況的影響，采用Hoechst33342和PI對(duì)大腸桿菌雙染。取50 mL濃度為105CFU/mL的菌懸液加樣品溶液，使AGE-1和AGE-2的石油醚部位的終濃度為其最低抑菌濃度，37 ℃培養(yǎng)24 h，另外以無(wú)菌水代替樣品溶液作為對(duì)照組。取 1 mL培養(yǎng)后的菌懸液加 10 μL濃度為 0.5 mg/mL的Hoechst 33342（激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)465 nm），37 ℃染色10 min，5000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清后分散于1 mL緩沖溶液，加5 μL濃度為1 mg/mL的PI染液避光染色10 min（激發(fā)波長(zhǎng)540 nm，發(fā)射波長(zhǎng)620 nm），緩沖溶液洗三次。滴加一滴處理好的大腸桿菌懸浮液到載玻片上，蓋上蓋玻片，然后利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察[13]。

1.3.6 掃描電鏡觀察

為了研究AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌形態(tài)的影響，取50 mL濃度為105CFU/mL的大腸桿菌菌懸液分別與AGE-1和AGE-2的石油醚部位混合培養(yǎng)，使AGE-1和AGE-2的石油醚部位的濃度為其最低抑菌濃度，以無(wú)菌水代替樣品作為對(duì)照組，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)24 h后5000 r/min離心5 min，棄上清，菌體用2.5%的戊二醛固定24 h，5000 r/min離心5 min棄上清，超純水清洗三次后菌體分散于超純水中。取一滴菌懸液滴加到載玻片上冷凍干燥后噴金，掃描電子顯微鏡觀察[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 最低抑菌濃度測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定了AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為31 μg/mL 和 62 μg/mL。

2.2 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響

為了研究石油醚部位對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，將AGE-1和AGE-2石油醚部位分別與大腸桿菌混合培養(yǎng)48 h，AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響見圖 1，實(shí)驗(yàn)中正常對(duì)照組很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h以后OD600保持穩(wěn)定。AGE-1和 AGE-2石油醚部位處理組降低了大腸桿菌的OD600，培養(yǎng)12 h后大腸桿菌的OD600有一定程度的增加，但始終低于正常對(duì)照組，說明AGE-1和AGE-2石油醚部位在其最低抑菌濃度下抑制大腸桿菌的活性，培養(yǎng)12 h后大腸桿菌能夠再次進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育但生長(zhǎng)速度受到限制，導(dǎo)致其OD600始終低于正常對(duì)照組。

圖1 石油醚部位對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effects of petroleum ether fractions on the growth curve of Escherichia coli

2.3 細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏

將AGE-1和AGE-2石油醚部位在其最低抑菌濃度下分別與大腸桿菌混合培養(yǎng)48 h，采用分光光度計(jì)對(duì)培養(yǎng)液中核酸等大分子物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖2，與正常對(duì)照組相比，AGE-1和AGE-2石油醚部位導(dǎo)致了培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的增加，該結(jié)果表明AGE-1和AGE-2石油醚部位造成了大腸桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷而導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏。

圖2 石油醚部位對(duì)大腸桿菌大分子物質(zhì)泄漏的影響Fig.2 Effect of petroleum ether fractions on large molecules leakage of Escherichia coli

2.4 培養(yǎng)液中電導(dǎo)率的變化

細(xì)菌細(xì)胞膜遭到破壞后，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)大量滲漏到培養(yǎng)液中導(dǎo)致培養(yǎng)液電導(dǎo)率增加，電導(dǎo)率變化可以反映出細(xì)胞膜通透性的變化。

將AGE-1和AGE-2石油醚部位在其最低抑菌濃度下分別與大腸桿菌混合培養(yǎng)，每2 h測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率，結(jié)果見圖 3，由圖可以發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組菌液的電導(dǎo)率一直處在比較低的水平，AGE-1和 AGE-2石油醚部位處理組電導(dǎo)率明顯高于正常對(duì)照組，且AGE-1石油醚部位處理組的電導(dǎo)率大于AGE-2石油醚部位。

以上結(jié)果說明AGE-1和AGE-2石油醚部位在各自最低抑菌濃度時(shí)造成了細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏，且AGE-1的石油醚部位對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用大于AGE-2的石油醚部位。

圖3 石油醚部位對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of petroleum ether fractions on conductivity of Escherichia coli culture fluid

2.5 激光共聚焦顯微鏡研究石油醚部位對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

圖4 處理24 h后大腸桿菌激光共聚焦顯微鏡拍攝圖Fig.4 Laser scanning confocal microscope image of Escherichia coli after exposure for 24 h

利用PI和Hoechst33342對(duì)大腸桿菌雙染后用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見圖4。Hoechst33342是細(xì)胞滲透性熒光染料，可以對(duì)所有細(xì)胞的DNA進(jìn)行染色，且健康細(xì)胞染色后呈現(xiàn)微弱的藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光[15]，PI可以對(duì)壞死細(xì)胞的DNA和RNA進(jìn)行染色并呈現(xiàn)紅色熒光[16]。圖4（a）中正常對(duì)照組多數(shù)細(xì)胞都呈微弱的藍(lán)色熒光，紅色熒光細(xì)胞較少；圖 4（b）和（c）中 AGE-1和 AGE-2石油醚部位最低抑菌濃度下處理24 h后細(xì)胞藍(lán)色熒光增強(qiáng)，表明AGE-1和AGE-2石油醚部位可以促使大腸桿菌細(xì)胞發(fā)生凋亡；紅色熒光細(xì)胞數(shù)量增加，表明AGE-1和AGE-2石油醚部位可以促使大腸桿菌細(xì)胞發(fā)生壞死；與正常對(duì)照組相比AGE-1和AGE-2石油醚部位在其最低抑菌濃度下分別處理24 h能夠促使大腸桿菌凋亡和壞死，提高了大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性使Hoechst33342的透過率增大，且AGE-1的石油醚部位對(duì)大腸桿菌的作用大于AGE-2的石油醚部位。

2.6 掃描電子顯微鏡觀察石油醚部位對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的影響

采用了掃描電子顯微鏡觀察石油醚部位對(duì)大腸桿菌表面形態(tài)的影響，結(jié)果見圖5。圖5（a）中對(duì)照組大腸桿菌培養(yǎng)24 h后菌體表面光滑，形態(tài)完整、飽滿，呈現(xiàn)典型的短桿狀，沒有細(xì)胞膜破損及內(nèi)容物的泄漏；圖5（b）中31 μg/mL的AGE-1石油醚部位處理24 h后菌體發(fā)生變形、凹陷，細(xì)胞表面粗糙，菌體之間互相黏連，甚至有菌體發(fā)生解體；圖5（c）中62 μg/mL的AGE-2石油醚部位處理24 h后菌體也發(fā)生變形和凹陷，細(xì)胞表面粗糙，菌體之間互相黏連；AGE-2石油醚部位處理組細(xì)胞受損情況小于 AGE-1石油醚部位處理組，該結(jié)果與培養(yǎng)液中電導(dǎo)率測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏測(cè)定結(jié)果以及激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果一致。細(xì)胞膜遭到破壞導(dǎo)致細(xì)胞表面粗糙，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)泄漏導(dǎo)致菌體之間互相黏連，并發(fā)生變形和凹陷。以上結(jié)果表明AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌具有損傷作用，可以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成細(xì)胞原生質(zhì)的泄漏。

圖5 處理24 h后大腸桿菌掃描電子顯微鏡圖（×10000）Fig.5 SEM image of Escherichia coli after exposure for 24 h(×10000)

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)分析了AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)AGE-1和AGE-2石油醚部位對(duì)大腸桿菌最低抑菌濃度分別為31 μg/mL和62 μg/mL。AGE-1和AGE-2的石油醚部位在其最低抑菌濃度下能夠抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)和大分子物質(zhì)的泄漏，并能對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成損傷，改變細(xì)胞膜的通透性，促使細(xì)胞凋亡或壞死，從而使大腸桿菌細(xì)胞表面粗糙，菌體之間互相黏連，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變形和凹陷。

3.2 課題組前期已經(jīng)對(duì)兩種自制老蒜提取物的抑菌活性以及可能的抑菌活性成分做了研究分析，發(fā)現(xiàn)AGE-1和AGE-2的石油醚部位含有多種具有二硫鍵的化合物如：二甲基三硫、二烯丙基二硫醚、3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-4-烯、3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯[8]，研究發(fā)現(xiàn)具有二硫鍵的化合物是大蒜中主要的抑菌活性物質(zhì)[6,7]，這些具有二硫鍵的化合物可以與具有巰基的氨基酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，阻礙含有巰基的氨基酸的正常利用，通過抑制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的正常合成起到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用；具有二硫鍵的化合物還可以與不含巰基的氨基酸反應(yīng)，影響一些酶的活性和一些生物過程[17]，使其表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。前期實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)AGE-1和AGE-2的石油醚部位含有多種有機(jī)酸和酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以阻礙細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的合成，并阻礙微生物細(xì)胞能量代謝及發(fā)育[18]。實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果驗(yàn)證了 AGE-1和AGE-2的石油醚部位可以抑制大腸桿菌的生物合成，培養(yǎng)液中核酸等大分子物質(zhì)和電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果，以及激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察證實(shí)了 AGE-1和 AGE-2的石油醚部位可以通過損傷大腸桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，致使細(xì)胞凋亡和壞死達(dá)到其抑菌效果。