周陸寧 張銳 麥晨 魏霜

摘要 針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604品系插入位點(diǎn)序列，分別設(shè)計(jì)品系特異性DPO引物，建立轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604品系檢測(cè)的多重DPO-PCR方法。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的DPO引物特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)0.5 ng/μL，并且對(duì)退火溫度不敏感。該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，適合于對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604品系進(jìn)行快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因玉米；MON810；MIR604；多重DPO-PCR

中圖分類號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）17-0001-02

Abstract Specific DPO primers based on the sequence of exogenous fragments of genetically modified maize MON810 and MIR604，a multiplex DPO-PCR method has been developed for the detection of genetically modified maize MON810 and MIR604 simultaneously. The specificity and sensitivity of the method have been tested，the results showed that the DPO primers were of high specificity，the sensitivity of the method was 0.5 ng/μL and insensitive to the annealing temperature. This method has strong specificity and high sensitivity，and is suitable for rapid detection of genetically modified maize MON810 and MIR604.

Key words genetically modified maize；MON810；MIR604；multiplex DPO-PCR

截至2016年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)1.851億hm2，同比增加3%[1]。隨著大量轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的涌現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題不容忽視。我國頒布了相關(guān)法律法規(guī)及條例，規(guī)定了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度及要求。

PCR是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的主要方法之一，但普通PCR檢測(cè)通量較低。多重PCR是在反應(yīng)體系內(nèi)加入多對(duì)引物，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶基因，在提高檢測(cè)通量的同時(shí)也降低了檢測(cè)成本。傳統(tǒng)多重PCR體系中，引物之間存在退火溫度、引物二聚體、錯(cuò)配等差異，容易造成靈敏度下降、非特異性擴(kuò)增等問題。

雙啟動(dòng)寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一種新型PCR引物設(shè)計(jì)方法[2]。原理：引物的5′端序列由18～25個(gè)堿基組成，而3′端序列由6～12個(gè)堿基組成，2段引物用寡聚次黃嘌呤（inosine，I）進(jìn)行連接，次黃嘌呤的退火溫度低，可以讓引物在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)，從而使引物形成2個(gè)獨(dú)立的雙特異性引物結(jié)構(gòu)。研究表明，DPO引物的5′端和3′端引物區(qū)域中任何一端有3個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配，PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行，大大提升了引物的特異性。該技術(shù)為多重PCR提供了一種新的引物設(shè)計(jì)方式，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌檢測(cè)中[3-7]。因此，本研究旨在建立基于DPO引物的多重PCR方法，用于同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604品系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品系：轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米MON863、轉(zhuǎn)基因玉米BT1

76、轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因油菜GT73、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、非轉(zhuǎn)基因玉米，樣品均保存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的插入序列兩端設(shè)計(jì)DPO引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.2 DNA提取。采用試劑盒法提取樣品基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 多重DPO-PCR體系建立。參考Takara多重PCR試劑盒的反應(yīng)體系：各引物終濃度均為0.4 μmol/L、DNA模板1.0 μL、Mix 1溶液0.25 μL、Mix 2溶液25 μL，用ddH2O調(diào)整反應(yīng)體系的體積至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR結(jié)束后，采用2.0%瓊脂糖電泳分析。

1.2.4 特異性評(píng)價(jià)。按照1.2.3多重DPO-PCR反應(yīng)體系，以轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米MON863、轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因油菜GT73、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、非轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA為模板，對(duì)多重DPO-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。

1.2.5 靈敏度評(píng)價(jià)。將轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的基因組DNA標(biāo)定濃度為50.00 ng/μL，再將其濃度稀釋為5.000、0.500、0.050、0.005 ng/μL，分別取1 μL作為模板進(jìn)行多重DPO-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)。

1.2.6 退火溫度敏感性試驗(yàn)。按照1.2.3多重DPO-PCR反應(yīng)體系，將退火溫度設(shè)為50～65 ℃，每5 ℃為1個(gè)梯度，共4個(gè)梯度，以轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的基因組DNA混合物為模板進(jìn)行退火溫度敏感性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重DPO-PCR檢測(cè)方法建立

由圖1可知，建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR檢測(cè)方法，多重DPO-PCR檢測(cè)結(jié)果與單重DPO-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，即在266 bp和127 bp處有特異性條帶。

2.2 特異性評(píng)價(jià)

由表2可知，轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604為陽性，而其他8種非靶目標(biāo)樣品均為陰性，所建立的多重DPO-PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。

2.3 靈敏度評(píng)價(jià)

由圖2可知，DNA模板含量在50.000、5.000、0.500 ng/μL時(shí)均可擴(kuò)增出2條目的條帶，且呈依次減弱；當(dāng)模板含量降到0.050 ng/μL以下時(shí)，未能擴(kuò)增到目的條帶。

2.4 退火溫度敏感性試驗(yàn)

由圖3可知，多重DPO-PCR在50、55、60、65 ℃這4個(gè)退火溫度梯度下均能擴(kuò)增出目的基因，表明建立的多重DPO-PCR檢測(cè)方法對(duì)退火溫度不敏感。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的DPO引物特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)0.500 ng/μL，且對(duì)退火溫度不敏感，由此建立了多重DPO-PCR方法用于轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的檢測(cè)。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、對(duì)退火溫度不敏感，適用于食品、飼料等樣品中這2個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系的快速篩檢。

4 參考文獻(xiàn)

[1] CLIVE JAMES.2015年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].中國生物工程雜志，2016，36（4）：1-11.

[2] CHUN J Y，KIM K J，HWANG I T，et al.Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene[J].Nucleic Acids Res，2007，35（6）：40.

[3] 張娜，乾義柯，魏霜，等.兩種向日葵檢疫性真菌病害的多重DPO-PCR檢測(cè)方法[J].植物檢疫，2015（6）：35-38.

[4] 李丹丹，徐義剛，王昱，等.創(chuàng)傷弧菌DPO-PCR檢測(cè)方法的建立[J].食品科技，2015，40（11）：287-290.

[5] 徐義剛，李丹丹，劉忠梅，等.產(chǎn)腸毒性大腸桿菌 DPO-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2013，33（11）：75-80.

[6] 徐義剛，李丹丹，崔麗春，等.應(yīng)用DPO-PCR技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸桿菌O157∶H7[J].食品科學(xué)，2014，35（8）：160-164.

[7] 徐義剛，李丹丹，劉忠梅，等.應(yīng)用DPO-PCR方法特異性檢測(cè)志賀氏菌[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（3）：28-31.