項錫勇　黃浩　宋方茗

摘要：本文選用小鼠LPS骨溶解模型探索骨外科手術(shù)模擬操作的可行性。實驗證明LPS骨溶解模型能夠較真實地模擬人類骨關(guān)節(jié)炎情況，可利用頭顱注射法，達到LPS骨溶解模型的建立，采用雙蒸水制備LPS溶液，最后在HE及TRAP染色的條件下，利用儀器來進行骨溶解的觀察及計算破骨細胞計數(shù)及TRAP數(shù)量和骨陷窩變化。采用小鼠LPS骨溶解模型進行骨關(guān)節(jié)炎模擬的臨床前教學(xué)，可以提高學(xué)生對骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生機制和治療體系的理解，強化學(xué)習(xí)效果，值得在醫(yī)學(xué)本科生教學(xué)和各層次骨學(xué)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班操作課程中進一步推廣。

關(guān)鍵詞：LPS；局部骨溶解模型；破骨細胞；TRAP；骨陷窩；臨床前教學(xué)

中圖分類號：G642.0 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2018）44-0214-02

一、前言

隨著時代的發(fā)展，人們的生活水平不斷改善和提高，生活方式也隨之改變，但骨關(guān)節(jié)病的患病率卻在逐年增加，因而對于骨關(guān)節(jié)病的治療人們也開發(fā)了許多方法，其中人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是最能有效治療晚期骨關(guān)節(jié)病和恢復(fù)關(guān)節(jié)功能的一種有效方法，也是目前臨床上治療晚期骨關(guān)節(jié)病的重要方法。但該種方法也存在著許多問題從而導(dǎo)致手術(shù)的失敗，例如無菌性松動和假體周圍骨溶解這兩種因素。有研究發(fā)現(xiàn)在UHMWPE導(dǎo)致的骨溶解的鼠模型中有內(nèi)毒素的積聚現(xiàn)象，其主要成分是LPS，因此骨溶解及骨吸收等可能與LPS密切相關(guān)。炎癥性骨疾病中骨生長重建規(guī)律尚不明確，而通過研究LPS介導(dǎo)下炎癥性骨疾病中破骨細胞的分化和活性調(diào)控機制，對于明確其規(guī)律起重大作用，同時也能為感染性骨疾病的治療提供新方向。

人工關(guān)節(jié)置換從設(shè)計—應(yīng)用—改進—再應(yīng)用經(jīng)歷了近百年的發(fā)展，已經(jīng)成為治療關(guān)節(jié)疾病的標(biāo)準手術(shù)之一。在發(fā)達國家，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)已經(jīng)成為對嚴重的髖、膝關(guān)節(jié)病變施行外科重建的常規(guī)手術(shù)方法，它的目的是解決關(guān)節(jié)的疼痛問題、改善關(guān)節(jié)使其運動功能得到恢復(fù)以及矯正關(guān)節(jié)畸形。雖然人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后關(guān)節(jié)活動較好，可早期下地活動，能減少老年患者長期臥床等，但術(shù)后仍可發(fā)生假體磨損、假體無菌性松動、假體周圍骨折骨關(guān)節(jié)置換等狀況，假體磨損或假體顆?；蚣袤w有細菌殘留，容易導(dǎo)致炎癥，從而導(dǎo)致骨破壞，最終手術(shù)失敗，讓患者再次經(jīng)歷二次手術(shù)。[1]骨髓炎、內(nèi)置物手術(shù)后感染易引起持久性炎癥反應(yīng)，不僅損害病人身心健康，而且給病人經(jīng)濟帶來負擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計假體術(shù)后感染并發(fā)癥的醫(yī)療支出人均約50000美元，全美每年達2500億美元。[2]人工關(guān)節(jié)的無菌性松動是影響關(guān)節(jié)置換術(shù)后遠期療效的主要因素。在無菌性松動的假體周圍可以看見骨質(zhì)有明顯的溶解現(xiàn)象，使其支撐結(jié)構(gòu)破壞，致使假體松動。[3]近年來，越來越多的臨床實踐表明，脂多糖可黏附多種人工假體材料并刺激細胞產(chǎn)生多種溶骨性因子，從而促進骨溶解。為了適應(yīng)時代發(fā)展趨勢，為骨關(guān)節(jié)手術(shù)教學(xué)提供更多、更具有實用性的教學(xué)研究平臺，我們對通過建立C57小鼠局部骨溶解模型模擬LPS誘導(dǎo)骨溶解進行了嘗試和評價。

二、教學(xué)方法

1.LPS溶液制備：實驗采用雙蒸水配制成濃度為2g/L的LPS溶液，過濾除菌，-20℃保存；臨用前用雙蒸水溶液分別稀釋1.75g/L、1.5g/L、1g/L、500mg/L、250mg/L。

2.體內(nèi)骨溶解模型的制作：取生理狀態(tài)基本相同的C57小鼠30只，其中5只作為空白對照，其余25只隨機分為五組實驗組1、2、3、4、5，分別定期（共計四次，隔天注射，即第一天、第三天、第五天、第七天）顱蓋骨骨膜注射濃度為1.75g/L、1.5g/L、1g/L、500mg/L、250mg/L的LPS溶液100μL。術(shù)后即第八天頸椎脫臼處死小鼠，取出完整顱蓋骨進行常規(guī)組織石蠟。

3.切片、HE及TRAP染色，顯微鏡下觀察軟骨組織學(xué)特征。[4]

4.骨溶解的觀察及計算：組織蠟塊用德國LeicaRM2135切片機切片，連續(xù)三層切片，層厚3.5μm。行常規(guī)HE染色，10×、20×及40×條件下觀察，40×條件下攝像。圖像用Maticimages2.0軟件處理，計算正中矢狀線區(qū)域骨吸收溶解面積，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差表示。[5]

5.破骨細胞計數(shù)及TRAP數(shù)量和骨陷窩變化：抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）是破骨細胞的特異性染色[6]。組織蠟塊用德國LeicaRM2135切片機切片，連續(xù)三層切片，層厚3.5μm。按說明書操作，將切片浸泡，避光37℃溫箱溫育90分，著色完全后移去反應(yīng)液，脫水干燥后明膠封。Olympus電子顯微鏡20×、40×及100×條件下觀察，10×條件下攝像計算正中矢狀線區(qū)域的TRAP+細胞數(shù)量，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差表示。觀察每個細胞中骨陷窩大小、數(shù)量、深度。

三、預(yù)期結(jié)果

1.實驗組與對照組相比，對照組中的基本沒有骨溶解現(xiàn)象，實驗組在圖像中可明顯觀察到骨溶解的面積。而在電子顯微鏡觀察下的切片中可清晰地看到實驗組的破骨細胞、TRAP數(shù)量明顯多于對照組，并且骨陷窩深度更深、面積更大、數(shù)目更多。

2.在五組實驗組中，隨著LPS溶液濃度的增大，骨溶解現(xiàn)象更加明顯，具體表現(xiàn)在骨溶解面積變大，破骨細胞、TRAP數(shù)量增多，以及骨陷窩深度更深、面積更大、數(shù)目更多。

四、討論

對全科醫(yī)師骨關(guān)節(jié)炎治療技術(shù)繼續(xù)教育課程或是醫(yī)學(xué)本科生教學(xué)來說，怎樣讓學(xué)員獲得更多有關(guān)基礎(chǔ)骨外科手術(shù)操作的親身真實體會，將得到的實踐感知與理論知識結(jié)合，保正將所學(xué)的醫(yī)學(xué)技術(shù)適當(dāng)、精確地運用到臨床手術(shù)中，最后為患者帶來真正有效的治療，一直都是醫(yī)學(xué)教育工作者探討的熱點問題。所以在醫(yī)學(xué)本科生教學(xué)或骨科學(xué)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班課程中，對學(xué)生進行有效的骨溶解模型臨床前培訓(xùn)就顯得十分重要。

根據(jù)以往所采用的教學(xué)方式而言，例如動畫模擬、臨床實踐見習(xí)和塑料橡膠模型等方式，就其結(jié)果所反映效益來說，以動物模型標(biāo)本為對象的骨關(guān)節(jié)手術(shù)臨床前模擬操作方式最能讓學(xué)生學(xué)到有用知識，最大限度符合教學(xué)預(yù)期效果。值得一提的是，此類教學(xué)方式與許多專家學(xué)者所主張的“在沒有真實病人的情況下為學(xué)員提供一個真實模擬環(huán)境以及反復(fù)練習(xí)新技術(shù)的機會”思想不謀而合。而在我們的實驗中，所采用小鼠局部骨溶解模型方法就能夠較真實地模擬人類骨關(guān)節(jié)組織情況，猶如在真人骨關(guān)節(jié)中一樣，便于學(xué)生與老師實施各類基礎(chǔ)骨關(guān)節(jié)手術(shù)操作練習(xí)及展示，不僅實踐感覺真實和視野清楚，更能給骨外科病學(xué)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班課程學(xué)習(xí)或醫(yī)學(xué)本科生教學(xué)提供了良好的基礎(chǔ)骨關(guān)節(jié)手術(shù)臨床前教學(xué)平臺，值得全方位地推廣和使用。

參考文獻：

[1]段鋼，朱自強.脂多糖對人工關(guān)節(jié)磨屑誘導(dǎo)的骨溶解的影響[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，28（4）：242-244.

[2]范衛(wèi)民，王青，陶松年，等.腫瘤壞死因子與人工關(guān)節(jié)無菌性松動關(guān)系的探討[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，20（2）：117-118.

[3]周景輝，吳耀持，李石勝，朱偉民，張圣宏.鼠類膝骨關(guān)節(jié)炎模型的評價[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（33）：6206-6209.

[4]王婧，張忠輝.大鼠關(guān)節(jié)炎三種動物模型的建立和比較[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2010，32（3）：456-460.

[5]張亮，陳志榮.一種磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解模型的制作[A].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30（4）：298-299.

[6]朱彤，劉勇章，胡小鵬.家兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎動物模型的建立[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2006，23（8）：1188-1190.

Abstract：The feasibility of using LPS osteolysis model to explore the operation of bone surgery was studied. Experiment proved that LPS bone dissolve model can simulate a real human osteoarthritis，head shots，available to dissolve the LPS bone model，adopt double LPS solution，and finally in the steaming water preparation HE stain and TRAP conditions，using the instrument for bone dissolve observation and calculation，broken bone cell count and number of the TRAP and the bone pit changes. The osteoarthritis LPS in mice bone dissolve model simulation of preclinical teaching，and can improve students' understanding of osteoarthritis occurred mechanism and treatment system，strengthen the study effect，is worth in the medical undergraduate teaching and at all levels continue to education to accelerate the operation course of further promotion

Key words：LPS；partial osteolysis model；osteoclasts；the TRAP；the bone pit；preclinical teaching