張?zhí)煸矗?楊瑞琴， 郝紅霞

(1.中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100038；2.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室， 北京 100088)

0 引言

核酸適配體是單鏈結(jié)構(gòu)的DNA或RNA序列，通常有15～40個堿基長度，它可與蛋白質(zhì)或其他有機和無機分子結(jié)合[1]。核酸適配體具有高親和力、特異性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，且無免疫原性。此外，與篩選抗體的生物學(xué)過程不同，核酸適配體是體外化學(xué)合成的，可以很容易地進行修飾，因此被稱為“化學(xué)抗體”[2]。

目前，利用核酸適配體為識別元件并結(jié)合其他檢測技術(shù)，已經(jīng)構(gòu)建了多種類型的檢測方法，包括表面等離子體共振(SPR)[3]、比色法[4]、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)[5]、電化學(xué)法[6]、表面強化拉曼散射法[7]以及熒光法[8]。其中，熒光法在構(gòu)建基于適配體的生物傳感技術(shù)中最為常用，這是由于熒光法在保證高靈敏度和準(zhǔn)確性的同時，還能實現(xiàn)對待測物的高通量檢驗分析。然而，大部分現(xiàn)有的方法需要利用熒光(淬滅)基團來標(biāo)記核酸或者對適配體上的堿基進行修飾[9]，無法實現(xiàn)快速檢驗。相反，非標(biāo)記熒光法無需對適配體進行修飾，具有操作簡單、靈敏度高、成本低等優(yōu)點。因此，基于適配體的非標(biāo)記熒光檢測技術(shù)為靶標(biāo)的快速檢測提供了可能。

1 適配體的篩選

核酸適配體是通過體外篩選和擴增技術(shù)得到的一段寡核苷酸序列，20世紀(jì)90年代初，Tuerk和Gold[10]通過T4 DNA聚合酶篩選實驗，首次提出并命名了SELEX技術(shù)。其基本原理主要包括以下3個步驟[11]：如圖1所示，第一步，合成一個含有1012～1015個隨機序列的寡核苷酸文庫，通常每個序列含有20～50個堿基，每條單鏈的兩端是與引物結(jié)合的保守序列。第二步，隨機序列文庫在適宜的溫度和緩沖體系條件下與靶分子混合孵育，再分離與靶物質(zhì)有強親和力的結(jié)合序列。第三步，通過PCR技術(shù)將第二步得到的DNA進行擴增，變性成單鏈以備下一輪篩選；若為RNA SELEX，則需要運用逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來實現(xiàn)RNA的擴增，擴增得到的產(chǎn)物形成寡核苷酸亞庫，用作新一輪的篩選。這3步組成了SELEX技術(shù)的一個循環(huán)周期。分離被篩選出的核酸，SELEX篩選結(jié)束。5～15輪的SELEX篩選后，解離常數(shù)(Kd)在皮摩爾到納摩爾范圍，最終形成含有高親和力的核酸序列。然而，傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)在獲得高質(zhì)量的適配體方面仍然存在技術(shù)瓶頸，為了縮短篩選周期和提高結(jié)合率，CE-SELEX[12]、MAI-SELEX[13]、AEGIS-SELEX[14]、ES-SELEX[15]、MSD-SELEX[16]等新的篩選技術(shù)已被成功地運用于高特異性適配體的篩選。

圖1 SELEX技術(shù)原理示意圖[17]

2 非標(biāo)記熒光技術(shù)的研究進展

基于適配體的熒光技術(shù)的機理是將適配體作為生物識別元件，適配體與靶標(biāo)的結(jié)合引起整個體系的熒光強度發(fā)生改變，從而達到檢測目標(biāo)物的目的。當(dāng)前，已經(jīng)開發(fā)出眾多基于適配體的熒光檢測方法，一般分為標(biāo)記型熒光檢測法和非標(biāo)記型熒光檢測法兩大類。

標(biāo)記型熒光檢測法的基本思想是把熒光基團和淬滅基團或者熒光供體和受體基團修飾在適配體的末端或者活性位點上[18]。適配體與靶標(biāo)結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化。從而改變熒光基團的相對位置，導(dǎo)致熒光強度發(fā)生變化，然而該方法操作步驟復(fù)雜、費時并且成本較高，甚至?xí)@著降低適配體與靶標(biāo)的結(jié)合力產(chǎn)生較高的背景信號，影響檢測結(jié)果，不利于高靈敏度測定[19]，這些因素促進了用于檢測適配體靶向結(jié)合后構(gòu)型變化的光敏化合物或嵌入染料的發(fā)展。目前，迫切需要開發(fā)一種非標(biāo)記、靈敏、準(zhǔn)確、高效的熒光檢測技術(shù)。

非標(biāo)記型熒光檢測法的機理是靶標(biāo)直接與適配體結(jié)合改變了適配體的二級結(jié)構(gòu)，或者通過互補序列以競爭的方式與適配體雜交，這些識別過程改變了適配體周圍的環(huán)境，進而減弱或增強熒光物質(zhì)與適配體間的作用即熒光信號的強弱[20]。近年來，相關(guān)研究人員利用不同的熒光物質(zhì)開發(fā)了多種適配體非標(biāo)記熒光檢測技術(shù)，根據(jù)熒光信號的產(chǎn)生機理，主要分為3類：染料嵌入型、信號放大型和納米顆粒結(jié)合型。下面將對現(xiàn)有的適配體非標(biāo)記熒光技術(shù)進行歸納、總結(jié)。

2.1 染料嵌入型

在嵌入型熒光法中，熒光染料通過嵌入、電荷作用及分子堆積等方式與適配體或含有適配體的雙鏈DNA相互作用，從而導(dǎo)致熒光產(chǎn)生或淬滅。

一部分熒光染料由于水分子氫鍵的作用，抑制了熒光的產(chǎn)生，導(dǎo)致溶液熒光信號極弱。但當(dāng)溶液中出現(xiàn)dsDNA時，染料分子與雙鏈結(jié)構(gòu)嵌合后，熒光強度增強；當(dāng)體系中的dsDNA轉(zhuǎn)換成ssDNA時，熒光信號逐漸減弱。這類染料是基于對單、雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)差異來改變熒光信號的強度，從而達到檢測目的。

Wang等[21]利用適配體和PicoGreen構(gòu)建了一種非標(biāo)記的檢測法。PicoGreen是一種新型的商業(yè)化染料，如圖2所示，它與dsDNA結(jié)合產(chǎn)生很強的熒光信號，游離于溶液中PicoGreen不產(chǎn)生熒光。實驗原理為：將適配體與等體積的cDNA雜交，得到具有雙鏈結(jié)構(gòu)的aptamer/cDNA，隨后加入含有靶物和能夠嵌入雙鏈的PicoGreen混合溶液。混合后的產(chǎn)物夾在蓋玻片和鍍有銀膜(SIFs)的載玻片之間，靶物與適配體競相結(jié)合使aptamer /cDNA的雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出PG染料和cDNA，游離的PG染料不與單鏈的cDNA結(jié)合，導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)沒有靶物存在時，SIFs與PicoGreen之間存在金屬增強熒光效應(yīng)(MEF)，從而增強了體系的熒光，熒光強度與靶標(biāo)濃度成反比。作者用該方法檢測了ATP和凝血酶，檢出限分別為1.3nM和0.073nM。運用該方法檢測血清中的ATP，熒光淬滅效率較緩沖液中的ATP樣本降低了7.4%，能夠檢出5.2nM的ATP，該檢測法在檢測實際樣本中的ATP效果更好。Luan[22]等采用相同原理，利用PicoGreen實現(xiàn)了水中鎘離子的快速檢測，檢出限為0.038 ng/mL。

圖2 雙鏈嵌入型染料PicoGreen檢測靶標(biāo)

Li等[23]設(shè)計了一種檢測凝血酶的熒光分子開關(guān)，其中，溴化乙淀(EB)為熒光基團，適配體為識別基團。實驗原理為：EB分子呈扁平狀，它可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，游離于溶液中的EB顯示出很低的熒光強度，在與dsDNA或雙股RNA結(jié)合時，熒光強度明顯增強，而對于ssDNA或RNA不會產(chǎn)生明顯的熒光強度增強現(xiàn)象。首先，通過SELEX技術(shù)篩選出抗凝血酶的ssDNA，篩選出的適配體有15個堿基序列并且與其互補鏈形成dsDNA；加入EB后，形成EB-dsDNA復(fù)合物，體系熒光強度增強，EB熒光強度是游離態(tài)的11倍。凝血酶存在時，構(gòu)成EB-dsDNA-thrombin復(fù)合物導(dǎo)致雙鏈解開并釋放EB染料和互補鏈，體系的熒光強度迅速減弱。熒光強度隨溶液中凝血酶含量的上升而減弱，檢出限為2.8nM。

Xu等[24]開發(fā)了一種以孔雀石綠(MG)為報告基團的非標(biāo)記熒光傳感器，原理是MG染料與其適配體結(jié)合會產(chǎn)生熒光，當(dāng)MG游離于溶液中時，幾乎沒有熒光產(chǎn)生。該傳感器中含有兩條核苷酸鏈，一條鏈?zhǔn)窍佘蘸蚆G的適配體共軛嵌合體，另一條作為互補鏈——橋接ssDNA，兩條鏈形成dsDNA，從而抑制了MG與其適配體的結(jié)合，當(dāng)有腺苷存在時，腺苷與腺苷適配體特異性結(jié)合，雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，橋接鏈脫離適配體鏈，MG與MG適配體結(jié)合，體系的熒光強度顯著增強，熒光強度越強表明腺苷濃度越高，檢出限為20 μM。

Daniel等[25]設(shè)計了一種基于適配體的非標(biāo)記熒光法檢測可卡因。核酸適配體MNS-4.1既能特異性結(jié)合可卡因也能和熒光分子ATMND結(jié)合，并且適配體與ATMND結(jié)合導(dǎo)致熒光淬滅?？煽ㄒ虼嬖跁r，適配體與可卡因結(jié)合形成Y型結(jié)構(gòu)復(fù)合物，使已經(jīng)與適配體結(jié)合的ATMND被迅速地釋放到溶液中，溶液中游離的ATMND產(chǎn)生很強的熒光，熒光強度與可卡因的濃度成正比。在適配體MNS-4.1的基礎(chǔ)上，通過G-T搖擺配對得到適配體38-GT，再用G-C堿基對替換G-T堿基對，最終得到適配體38-GC。相較于MNS-4.1，適配體38-GC對可卡因和ATMND有更強的結(jié)合能力并且能夠增強整個體系的熒光信號?；谶m配體38-GC和熒光物質(zhì)ATMND的熒光檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對可卡因的快速檢測，檢出限為200nM。更重要的是，該技術(shù)已成功應(yīng)用于唾液、尿液和血清中可卡因的檢測，檢出限分別為10.4 μM、18.4 μM和36 μM。

G四鏈體DNA(G4)是一種功能性核酸，隨機狀態(tài)的富含G的ssDNA通過折疊形成G四鏈體結(jié)構(gòu)[26]，G4的出現(xiàn)為靶標(biāo)檢測提供了另一種選擇。

Fan等[27]利用G四鏈體結(jié)構(gòu)的ssDNA、鉀離子和血晶素構(gòu)建了一種檢測鉀離子濃度的非標(biāo)記熒光傳感器。當(dāng)有鉀離子時，富G的ssDNA折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，血晶素與G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合形成DNA酶，HPPA被過氧化氫氧化，氧化反應(yīng)產(chǎn)物具有良好的熒光性能，鉀離子濃度越高，反應(yīng)產(chǎn)物濃度越高，熒光越強。鉀離子不存在時，富G的鉀離子適配體處于隨機狀態(tài)，不能形成DNA酶，從而無法催化HPPA與過氧化氫的氧化反應(yīng)。該傳感器檢測鉀離子濃度的線性范圍是2.5 μM至5 mM，作者利用該傳感器檢測了血清樣本中的鉀離子濃度，實驗結(jié)果表明該傳感器可以對實際樣本進行檢測。Mao等[28]運用相同的技術(shù)原理，利用熒光物質(zhì)ABTS被過氧化氫氧化生成的產(chǎn)物與G-四鏈體結(jié)合，使熒光強度增強來檢測尿液中的甲基苯丙胺濃度，該方法對尿液中甲基苯丙胺的檢出限是0.5 nM。

Xing等[29]構(gòu)建了一種基于適配體的噻唑橙(TO)熒光探針檢測卡那霉素。如圖3，在溶液中游離的噻唑橙(TO)幾乎沒有熒光，但當(dāng)TO染料與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合時，能發(fā)出很強的熒光。實驗中，設(shè)計一條具有平行構(gòu)型G-四鏈體結(jié)構(gòu)(G4-DNA)的適配體，加入TO染料后，TO與G4-DNA迅速結(jié)合形成G4-DNA-TO復(fù)合物并產(chǎn)生很強的熒光信號。當(dāng)存在卡那霉素時，卡那霉素與適配體特異性結(jié)合，替換了G4-DNA-TO復(fù)合物上的TO染料，體系熒光強度迅速降低，熒光強度與溶液中卡那霉素的含量成反比，檢出限為59nM。此外，向牛奶中加入不同濃度的卡那霉素，考查該檢測法的回收率，得到的平均值范圍為80.1%～98.0%，這表明該方法在實際應(yīng)用中有較高的準(zhǔn)確度。

圖3 G4-DNA嵌入型染料噻唑橙檢測卡那霉素

此外，還有一類嵌入型的染料通過靜電吸附作用與適配體結(jié)合，游離態(tài)的染料顯示出較強的熒光，但與適配體結(jié)合后，由于聚集熒光淬滅效應(yīng)，熒光信號衰減。

Lv等[30]合成了一種水溶性苝酰亞胺染料(PTCDI)，PTCDI以單體的形式游離于溶液中且?guī)в袃蓚€正電荷，電荷間的斥力降低了它的堆積，從而顯示出很強的熒光強度。如圖4，由于凝血酶的適配體含有多個帶負(fù)電荷的磷酸基團。在靜電吸附非作用下，PTCDI單體吸附到適配體上，由于聚集誘導(dǎo)熒光淬滅效應(yīng)，體系熒光強度降低；加入靶標(biāo)凝血酶，適配體與凝血酶結(jié)合形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，釋放PTCDI單體，熒光強度恢復(fù)。該方法的檢出限為40pM。Wang[31]等運用相同的技術(shù)原理，利用PTCDI染料和溶菌酶的適配體檢測了溶菌酶，檢出限為0.07nM。

圖5 基于酶修復(fù)擴增的信號放大策略檢測病原菌

圖4 靜電吸附型苝二酰亞胺染料檢測凝血酶

上述染料嵌入型非標(biāo)記熒光法具有低成本、使用方便等優(yōu)點，但是，這類方法中采用的染料與核酸的結(jié)合位點不確定，不利于考察熒光染料在反應(yīng)體系中的性能，檢測結(jié)果易受到背景信號的干擾，因此，在不同的分析實驗中需要對其進行優(yōu)化。

2.2 信號放大型

信號放大技術(shù)是將核酸擴增與熒光技術(shù)聯(lián)用來提高檢測的靈敏度，這為超靈敏適配體熒光傳感器的設(shè)計提供了一種新的模式。

Leng等[32]利用酶修復(fù)擴增策略(ERA)構(gòu)建了一種熒光生物傳感器用于快速檢測病原菌。靶標(biāo)- 適配體結(jié)合介導(dǎo)的酶修復(fù)擴增反應(yīng)，在聚合酶和兩種DNA修復(fù)酶的作用下進行循環(huán)，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸內(nèi)切酶Ⅳ(Endo Ⅳ)被用作放大熒光信號。如圖5所示，實驗中，專門合成了一種發(fā)夾探針(HAP)，它被用作DNA模板，產(chǎn)生大量的報告寡核苷酸和輔助引物，引發(fā)新一輪的聚合修復(fù)循環(huán)。此外，通過核酸內(nèi)切酶IV催化的修復(fù)反應(yīng)，可以周期性地裂解熒光淬滅探針。聚合酶催化結(jié)合病變基質(zhì)與UDG和EndoⅣ輔助的酶修復(fù)擴增相結(jié)合，從而實現(xiàn)識別信號放大的多輪循環(huán)，最終達到快速檢測病原菌的目的。在理想條件下，該傳感器顯示出了很高的靈敏度，檢出限為9.86 cfu mL-1且檢測范圍為5個數(shù)級。

Xu等[33]基于外切核酸酶催化循環(huán)(ECTR)擴增策略和SYBR Green Ⅰ染料，構(gòu)建了一種檢測ATP的非標(biāo)記熒光傳感平臺。Exo Ⅲ的催化作用是從雙鏈DNA鈍性或凹陷的3’-羥基末端開始，逐步酶解單核苷酸，且對ssDNA或3’端突出的dsDNA無作用。ATP不存在時，含有ATP結(jié)合序列的發(fā)夾適配體和五個3’端突出的單核苷酸抗外切酶的水解，因此，SGI可以嵌入發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部，在520 nm的紫外光激發(fā)下產(chǎn)生強烈的熒光信號。相反，當(dāng)溶液中出現(xiàn)ATP時，它與適配體上相應(yīng)的序列結(jié)合后，發(fā)夾適配體重新配置得到3’端是凹陷末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而被Exo Ⅲ切割，釋放出ATP。被釋放的ATP再次與其他適配體上的序列結(jié)合，啟動下一輪的循環(huán)進程。這種自發(fā)的循環(huán)過程，導(dǎo)致大量發(fā)夾核酸適配體的裂解且使嵌入發(fā)夾適配體探針的SGI的數(shù)量急劇減少，從而抑制了熒光信號，實現(xiàn)了對ATP的高靈敏檢測，檢出限為9.5nM。

除酶誘導(dǎo)的信號放大策略外，還包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)放大(RCA)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCA)等，但是，這些擴增技術(shù)易受到環(huán)境和昂貴儀器設(shè)備等條件的限制。為此，F(xiàn)u等[34]基于發(fā)夾DNA的自組裝，開發(fā)了一種無酶的基于適配體和熒光染料NMM的非標(biāo)記熒光法。如圖6，H1和H2為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈，且H2中的位點4和位點5能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。位點4隱藏在發(fā)夾H2的莖部，因此，現(xiàn)階段無法形成G4。首先，由于Apt-C與抑制鏈(Inh)雜交，催化鏈的催化效應(yīng)被抑制。腺苷與適配體結(jié)合使Apt-C與Inh間的互補堿基對逐漸減少，從而大大減弱了雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致雙鏈解開，釋放出抑制鏈(Inh)。Apt-C的位點1被暴露出來隨后在發(fā)夾H1的1*位點成核，這引起分支遷移，H1暴露出位點3、4、1；發(fā)夾打開的H1成為位點3和發(fā)夾H2上3*位點間成核的新引發(fā)劑，隨著分支遷移作用，H2的位點3、2、1、4和5全部被展露出來，其中，位點3、2、1置換了Apt-C，得到了H1-H2自組裝后的復(fù)合物，且發(fā)夾H2的4、5位點在復(fù)合物的一端形成了G4。被釋放的Apt-C參與到下一輪的反應(yīng)過程中。加入熒光染料NMM，NMM對G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有很強的選擇結(jié)合能力，增強熒光信號，隨著腺苷濃度的增加，H1-H2復(fù)合物數(shù)量增加，所以，熒光強度與腺苷濃度成正比，此外，該方法不易受腺苷類似物的干擾，檢出限為6 μM。

圖6 基于DNA發(fā)夾自組裝信號放大策略的非標(biāo)記熒光技術(shù)檢測腺苷

Wang等[35]構(gòu)建了一種基于等溫循環(huán)擴增策略的比率熒光生物傳感器來檢測癌胚抗原(CEA)，檢測原理是：靶標(biāo)激發(fā)一個循環(huán)過程來分裂銀納米簇對(AgNCs)，導(dǎo)致其熒光信號減弱。同時，釋放出的大量G4序列增強了THT染料的熒光強度，最終達到檢測目的。實驗中，識別和擴增兩部分共同組成了一種DNA機制，使用兩種免標(biāo)記的熒光探針——ThT和AgNCs，當(dāng)CEA不存在時，在擴增部分中，G-DNA與帶有AgNCs的Ag-DNA1和Ag-DNA2雜交并在一端形成納米團簇對，得到很強的熒光信號(FAgNCs) ，同時，由于G4結(jié)構(gòu)的形成被抑制，ThT熒光信號(FTHT)極低；當(dāng)加入CEA時，在識別部分，發(fā)夾H-DNA特異性結(jié)合CEA，適配體構(gòu)象的改變暴露出激發(fā)序列引起了擴增；在擴增過程中，適配體/CEA復(fù)合物(H/C) 在立足域激發(fā)了一系列的鏈置換反應(yīng)從而抑制了銀納米簇對的形成，釋放出更多的G-DNA，ThT染料與三鏈結(jié)構(gòu)的G-DNA結(jié)合導(dǎo)致熒光強度(FTHT)的顯著增強，AgNCs熒光強度(FAgNCs) 的驟然下降?；诒嚷蔉THT/FAgNCs，從而實現(xiàn)對CEA定量檢測的高靈敏度和特異性，檢出限為0.1 ng/mL。同時，當(dāng)有其他干擾物存在時，該方法展現(xiàn)出對CEA優(yōu)異的選擇性。今后，在現(xiàn)階段的信號放大策略下，通過改變適配體的構(gòu)型還可以檢測其他生物標(biāo)志物，這為信號放大型非標(biāo)記熒光技術(shù)提供了新的思路，應(yīng)用前景廣闊。

2.3 納米顆粒結(jié)合型

基于納米顆粒的非標(biāo)記熒光檢測平臺具有反應(yīng)靈敏、無酶和特異性高等優(yōu)點，隨著納米材料技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料的選擇性越來越受到人們的關(guān)注。

納米金(AuNPs)具有較高的消光系數(shù)和隨尺寸變化的熒光特性，被視為最理想的納米顆粒，廣泛應(yīng)用于光學(xué)適配體傳感器[36]。

Gu等[37]利用分子刷型熒光共軛聚合物ThNI與納米金結(jié)合的策略來檢測溶菌酶。ThNI是一種高電荷密度的陽離子聚合物，如圖7，適配體通過很強的π-π堆積吸附在AuNPs的表面，基于此，AuNPs不會聚集且溶液呈紅色。帶負(fù)電荷的AuNPs/ssDNA復(fù)合物和正電荷的ThNI間的強烈的靜電相作用，導(dǎo)致AuNPs和ThNI間距變小，由于存在能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)，ThNI熒光淬滅。當(dāng)溶菌酶出現(xiàn)時，ssDNA與溶菌酶特異性結(jié)合，引起AuNPs大規(guī)模聚集，溶液呈藍色。由于高密度的刷型ThNI和大量AuNPs的聚集，AuNPs與ThNI之間達到一定距離，從而ThNI的熒光不淬滅。隨著溶菌酶濃度的增加，熒光信號逐漸增強，檢出限為10nM。該方法被成功地應(yīng)用于檢測人唾液中的溶菌酶，實驗中，滴加的的唾液量越多，溶液顏色由紅色變?yōu)樽仙罱K變成藍色，這進一步證明了該方法具有簡便、靈敏度高、快速和特異性好等優(yōu)點。

圖7 基于納米金和刷型共軛聚合物的非標(biāo)記熒光技術(shù)檢測溶菌酶

納米二氧化硅是構(gòu)建各類熒光傳感器中最常用的納米物質(zhì)，具有表面積大、化學(xué)性能穩(wěn)定和親水性強等特點。此外，納米二氧化硅還能夠增強熒光基團產(chǎn)生的熒光信號[38-39]。

Taghdisi等[40]利用納米二氧化硅(SNPs)和銅納米顆粒(CuNPs)構(gòu)建了一種熒光適配體傳感器來檢測γ-干擾素(IFN-γ)，該生物傳感器是基于銅納米顆粒(CuNPs)作為熒光報告基團 、鏈霉親和素包覆的納米二氧化硅(SNPs-Streptavidin)、對單鏈DNA有高特異性的結(jié)合蛋白(SSB)和含有核酸適體序列和聚胸腺嘧啶(T)序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸。沒有IFN-γ存在時，寡核苷酸以發(fā)夾結(jié)構(gòu)的狀態(tài)存在于鏈霉親和素包覆的納米二氧化硅表面，所以SSB未能與ssDNA結(jié)合。隨后加入銅離子和抗壞血酸，通過結(jié)合寡核苷酸中含有dsDNA和聚T序列的干區(qū)，形成銅納米顆粒，最終基于DNA模板的納米銅粒子釋放出很強的熒光信號。當(dāng)加入IFN-γ后，寡核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)解開，形成Aptamer/IFN-γ復(fù)合物，含有聚T序列寡核苷酸的3端變成ssDNA并與SSB結(jié)合，加入銅離子和抗壞血酸后，由于體系中不存在dsDNA和聚T序列，缺少了形成熒光銅納米顆粒的模板，因此，熒光信號極弱。該傳感器展現(xiàn)了理想的線性范圍10 pg/mL～4 ng/mL，在緩沖液中γ-干擾素的檢出限為1 pg/mL。同時，該方法成功應(yīng)用于檢測血清中的γ-干擾素，分析結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.1%，回收率在92.52%～98.32%之間。

量子點(QDs)是一種納米發(fā)光半導(dǎo)體晶體，具有獨特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，例如發(fā)射光譜峰窄而對稱；可得到與量子點尺寸相關(guān)、可調(diào)諧的吸收和發(fā)射光譜[41]等。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，量子點的光致發(fā)光具有很多優(yōu)勢，包括量子產(chǎn)率高、優(yōu)異的光穩(wěn)定性和更強的抗光漂白性,近年來，量子點作為新型的發(fā)光指示物備受人們的關(guān)注[42]。

Sun等[43]利用量子點和多吡啶釕配合物Ru設(shè)計了一種非標(biāo)記的DNA熒光傳感器檢測水溶液中的銀離子。量子點(QDs)作為熒光發(fā)射物，多吡啶釕配合物對DNA具有顯著的選擇結(jié)合特性，QDs與RU在水溶液中反應(yīng)，導(dǎo)致QDs熒光淬滅。該傳感器的檢測機理是：多吡啶釕配合物陽離子吸附在帶負(fù)電的量子點表面，吸附后的RU與QDs之間存在存在著光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，從而抑制了QDs產(chǎn)生熒光。實驗中，Ru(bpy)2dppz2+既作為熒光淬滅基團，又作為DNA的報告基團，如圖8所示，帶正電的多吡啶釕配合物和帶負(fù)電荷的水溶性CdTe量子點在水溶液中通過靜電吸附結(jié)合形成離子共軛物，這種靜態(tài)結(jié)合導(dǎo)致量子點熒光強度降低。隨后加入富C的單鏈DNA，由于釕配合物與DNA有更強的結(jié)合能力，所以RU從量子點表面脫離，量子點的熒光恢復(fù)。當(dāng)有銀離子出現(xiàn)時，形成C-Ag+-C配合物，誘導(dǎo)C-ssDNA折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這影響了RU與C-ssDNA結(jié)合，導(dǎo)致QDs熒光強度驟降。該平臺提供了一種簡單、靈敏、選擇性的方法檢測水溶液中的銀離子，檢出限為0.1 μM。

圖8 基于量子點的適配體非標(biāo)記熒光技術(shù)檢測銀離子

碳納米管因其獨特的光電性能和優(yōu)良的生物相容性，在生物傳感領(lǐng)域得到了較快的發(fā)展。He等[44]利用BPA適配體和Mo2C納米管開發(fā)了一種簡便、快速的方法檢測雙酚A(BPA)。Mo2C納米管是一種新型過渡金屬碳化物，相較于其他納米材料，二維超薄納米片含有更多的活性位點。實驗中，當(dāng)沒有BPA時，適配體與Help-DNA雜交后，在BPA適配體的富G分支GGGT和Help-DNA上5端的富G序列(TGGGTGGG TGGGT)之間形成G4。G4結(jié)構(gòu)富含鳥嘌呤(G)，G4能夠與小分子染料NMM結(jié)合，增強熒光信號；相反，BPA與適配體反應(yīng)且適配體發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換，阻礙了G4的形成，導(dǎo)致熒光淬滅。同時，Mo2C納米管能夠吸收Help-DNA從而減弱了富G序列(TGGGTGGG TGGGT)的背景信號。該方法檢測BPA的檢出限為2nM。在檢測真實樣本中，一系列濃度梯度的BPA溶液被實際的水樣本稀釋5倍，檢測得到的熒光減弱比率相似于檢測緩沖液中BPA的結(jié)果；更重要的是，該方法能從與BPA結(jié)構(gòu)相似的其他分子中鑒別出BPA，具有較高的實際應(yīng)用價值。

圖9 基于適配體的碳納米管技術(shù)檢測雙酚A

3 總結(jié)與展望

非標(biāo)記熒光法避免了對核酸適配體進行修飾，大大降低了成本，且該方法檢出限較低，使得非標(biāo)記的適配體熒光檢測技術(shù)發(fā)展迅速。此外，適配體與靶標(biāo)間是特異性結(jié)合，大部分熒光染料通過嵌合或者靜電作用與DNA或者RNA結(jié)合，使非標(biāo)記熒光法在特異性和靈敏度方面均優(yōu)于其他方法。由于合成陰陽離子聚合物的難度較大，而許多染料都是商業(yè)化的染料，易于得到，所以大部分的非標(biāo)記熒光法是利用染料作為信號報告基團，較少使用陰陽離子聚合物。但從總體上看，該方法存在以下幾個問題：(1)傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)操作繁瑣、篩選周期長；(2)針對的靶標(biāo)單一，限制了該方法在實際樣品檢測中的應(yīng)用。

基于此，對SELEX技術(shù)進行優(yōu)化能夠促進和縮短整個篩選過程，此外，在微流控芯片、納米技術(shù)、新的測序方法等相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展[45]，有助于構(gòu)建一系列新的SELEX技術(shù)，從而可以篩選獲得特異性、穩(wěn)定性更強的核酸適配體。通過運用納米顆粒和多種DNA擴增技術(shù)與傳統(tǒng)的適配體-染料非標(biāo)記熒光技術(shù)相結(jié)合，可以消除背景信號的干擾，增強熒光強度變化的信號，從而達優(yōu)化檢測結(jié)果的目的，這是適配體非標(biāo)記熒光技術(shù)今后發(fā)展的一個趨勢；此外，SELEX新技術(shù)的應(yīng)用和熒光染料的發(fā)展不斷優(yōu)化非標(biāo)記熒光技術(shù)，促使其朝著更高效、更簡便、低成本的趨勢發(fā)展。