西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，西藏 拉薩 850000

二十五味綠絨蒿丸系藏族驗(yàn)方，收載于1995年《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第一冊(cè)，由綠絨蒿、紅花、肉桂、沉香、牛黃、甘草、木香、葡萄、訶子、丁香等25味藥材組成，具有解毒、清肝熱的功效，臨床用于中毒及“木布”降于肝腑、肝熱、肝腫大、肝硬化、肝胃瘀血疼痛等新舊肝病。藏藥二十五味綠絨蒿丸以前都是以研究顯微鑒別為主，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有含量測(cè)定方法，為保證二十五味綠絨蒿丸質(zhì)量可靠性，經(jīng)查閱資料，研究以含量測(cè)定作為方向，對(duì)于保證其質(zhì)量和臨床療效具有重要意義[1]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 液相色譜儀(Waters公司)；Mettler XP205型電子天平(精密度為十萬(wàn)分之一)、Mettler XP504電子天平(精密度為萬(wàn)分之一)。色譜柱：安捷倫(5 μm, 250 mm × 4.6 mm) C18柱。

1.2 材料 乙腈(批號(hào)：2016.215)、甲醇(批號(hào)：20160824)為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其它試劑為分析純。羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào)：111631-201108，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。二十五味綠絨蒿丸(樣品1批號(hào)20100407，青海柴達(dá)木高科技藥業(yè)有限公司；樣品2批號(hào)07358A，西藏自治區(qū)藏藥廠；樣品3批號(hào)08038A西藏自治區(qū)藏藥；樣品4批號(hào)08038A，西藏自治區(qū)藏藥廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)；檢測(cè)波長(zhǎng)：402 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)，各約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入25%甲醇溶液25 mL，精密稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品18.10 mg，對(duì)照品純度91.8%，用25%甲醇溶解，定容于25 mL的容量瓶中，得對(duì)照溶液0.6646 mg /mL，進(jìn)樣量10 μL。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[2-3]

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取羥基紅花黃色素A適量用流動(dòng)相稀釋成一定的濃度，流動(dòng)相為空白。在190～450 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示在402 nm處有最大吸收，其與文獻(xiàn)相符[2]，故選擇402 nm作為本品的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱的理論板數(shù)(n)、分離度(R)測(cè)定：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)；檢測(cè)波長(zhǎng)402 nm；柱溫30℃；流速為1.0 mL/min；用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。在此條件下，羥基紅花黃色素A和其它組分均能達(dá)到基線分離(如圖1所示)。供試品中羥基紅花黃色素A保留時(shí)間與對(duì)照品一致。理論板數(shù)n≥4500；分離度R≥3.0，系統(tǒng)適用性良好。陰性樣品無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系的考察 精密稱取羥基紅花黃色素A，定容成相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，得到相應(yīng)的峰面積。以羥基紅花黃色素A對(duì)照品濃度為X坐標(biāo)，以相應(yīng)峰面積為Y坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得到回歸方程y=3E+06x-124011,R2=1。表明樣品在0～2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果如圖2所示。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 將同一濃度的羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液(2.2項(xiàng)下對(duì)照品液2)在上述色譜條件下，連續(xù)測(cè)定5次。根據(jù)所得峰面積，RSD=0.3%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱定樣品(西藏自治區(qū)藏藥廠，批號(hào)08038A)2.0145 g，按上述提取方法平行提取，制成樣品溶液，在上述色譜條件下在0、4、6、11、17、31 h測(cè)定測(cè)得羥基紅花黃色素A的峰面積，RSD=1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取樣品(西藏自治區(qū)藏藥廠，批號(hào)08038A)6份，分別加入相同量的羥基紅花黃色素A對(duì)照品，按照上述提取條件進(jìn)行提取，然后在上述色譜條件下測(cè)定，分析數(shù)據(jù)，計(jì)算回收率為93.7%，表明本方法回收率良好。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品含量 按上述提取和色譜條件[4-7]，對(duì)4批次的二十五味綠絨蒿丸進(jìn)行了含量測(cè)定，求得各樣品中羥基紅花黃色素A的含量，見(jiàn)表2。

表2 樣品中羥基紅花黃色素A的含量

3 討論

3.1 前處理方法的選擇 根據(jù)有關(guān)資料分別用3種提取溶劑：甲醇、50%甲醇及25%甲醇各自分別用超聲30 min、室溫冷浸24 h、加熱回流0.5 h提取。按照以上色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明加入25%甲醇超聲30 min，提取率較高，故選用25%甲醇為提取溶劑，選用超聲30 min為提取方法。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液為供試品溶液。

3.2 流動(dòng)相的選擇 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)402 nm；柱溫30℃；流速為1.0 mL/min; 用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。在此條件下經(jīng)不同溶劑系統(tǒng)相比較，使用甲醇-0.7%磷酸溶液(30∶70)；乙腈-0.7%磷酸溶液(30∶70)；甲醇-0.7%磷酸溶液(35∶75)；甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(35∶5∶60)等系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)流動(dòng)相具有柱壓低、峰形和分離度佳及分析時(shí)間較短的特點(diǎn)，因此確定流動(dòng)相采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)。

綜上，該方法系統(tǒng)適用性、專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性考察及加樣回收方面均符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。說(shuō)明本方法測(cè)定羥基紅花黃色素A含量是準(zhǔn)確和可行的。最后以平均含量下浮20%作為本品的含量限度標(biāo)準(zhǔn)，故暫定本品每克含羥基紅花黃色素A(C27H32O16)不得少于0.50 mg/g。