袁東波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，尹 杰，周明忠，郝力力，陽(yáng)愛(ài)國(guó)

(四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都610041)

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)引發(fā)的棘球蚴病，統(tǒng)稱包蟲(chóng)病，是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，主要感染人、牛羊等家畜以及小型嚙齒類動(dòng)物。包蟲(chóng)病不僅嚴(yán)重危害居民健康，而且導(dǎo)致包蟲(chóng)病患者因病返貧，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。四川[1-2]、青海、寧夏、甘肅[3]以及新疆等省是包蟲(chóng)病高發(fā)地區(qū)，其中四川省的甘孜州和阿壩州全州、雅安市的天全縣和寶興縣以及涼山州的木里縣和越西縣均是包蟲(chóng)病流行區(qū)域。

人和動(dòng)物感染包蟲(chóng)病主要是經(jīng)口感染(比如誤食被包蟲(chóng)蟲(chóng)卵污染的水和食物，手接觸了被蟲(chóng)卵污染的土壤或者犬的皮毛)，蟲(chóng)卵經(jīng)口進(jìn)入胃，在宿主消化液作用下發(fā)育成六鉤蚴經(jīng)腸壁進(jìn)入血液。中絳期的幼蟲(chóng)可在患者及動(dòng)物體內(nèi)像腫瘤樣生長(zhǎng)發(fā)育和侵潤(rùn)遷移，對(duì)肝臟等臟器損害嚴(yán)重。包蟲(chóng)的蟲(chóng)卵已在孕節(jié)內(nèi)提前發(fā)育為六鉤蚴，不需要在外界環(huán)境中發(fā)育，因此隨糞便排出的蟲(chóng)卵已經(jīng)完全發(fā)育成熟，對(duì)人和其他中間宿主均已具有感染力。除此之外，蟲(chóng)卵對(duì)低溫抵抗力極強(qiáng)，能在外界環(huán)境中長(zhǎng)期存活并保持感染力。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵-80 ℃至少需要7 d方能徹底滅活，而在7 ℃可存活200 d以上，21 ℃可存活50天[4-5]。多房棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵在實(shí)驗(yàn)室4 ℃水中可存活16個(gè)月[4-5]。在德國(guó)南部，秋冬季節(jié)可存活8個(gè)月，夏季可存活78 d，在潮濕土壤中也可存活很長(zhǎng)時(shí)間[6]。

本試驗(yàn)的目的是對(duì)本省包蟲(chóng)病流行地區(qū)自然環(huán)境中包蟲(chóng)蟲(chóng)卵污染情況進(jìn)行初步調(diào)查，為進(jìn)一步完善包蟲(chóng)病防控措施提供數(shù)據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 共采集新鮮犬糞850份，其中：石渠縣103份、爐霍縣97份、甘孜縣90份、天全縣281份、寶興縣279份；土壤樣本61份，取地表土層1 cm內(nèi)的土壤，每份100 g左右，其中：石渠縣A鄉(xiāng)20份、石渠縣B鄉(xiāng)21份，爐霍縣10份、色達(dá)縣10份，所有土壤樣本均采集于犬舍為中心100平米范圍內(nèi)；犬頸部毛發(fā)樣本39份，其中石渠縣A鄉(xiāng)20份、石渠縣B鄉(xiāng)19份；公路旁地表水樣本80份，其中石渠縣A鄉(xiāng)30份、石渠縣B鄉(xiāng)10份、石渠縣C鄉(xiāng)20份以及爐霍縣20份，每份50 mL左右。由于犬糞是環(huán)境中蟲(chóng)卵的唯一來(lái)源，所以采集犬糞、犬舍周圍土壤及犬毛過(guò)程中，必須做好安全防護(hù)，避免感染包蟲(chóng)蟲(chóng)卵。

1.2 主要試劑及儀器 Power SYBR Green PCR Master Mix，購(gòu)自ABI公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；糞便及土壤樣本徹底破碎采用Bertin Precellys 24組織破碎儀；樣本總DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit；最終檢測(cè)儀器為杭州博日9600型熒光PCR儀。

1.3 核酸的提取 所有樣本的核酸提取均采用E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。其中，土壤及犬糞樣本需用Bertin Precellys 24組織破碎儀充分破碎后再進(jìn)行核酸提??；水體樣本需至少13 000 r/min離心5 min后收集沉淀，再進(jìn)行核酸提??；犬毛需在50 mL試管中，用超純水充分震蕩洗滌后，13 000 r/min離心5 min后收集沉淀，提取核酸。所有樣本最后洗脫的總DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)方法 通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1，G6和G7株及多房棘球絳蟲(chóng)大量序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取線粒體上ND1基因作為檢測(cè)基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為98 bp，所用引物序列及反應(yīng)體系均采用先前本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[7]。PCR體系為50 μL，上下游引物終濃度分別為0.3 μmol/L，模板1-3 μL(約為5 ng)。反應(yīng)條件為預(yù)變性：94 ℃5 min；變性94 ℃30s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，按照儀器默認(rèn)設(shè)置添加熔解曲線分析步驟。其中陽(yáng)性對(duì)照細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)陽(yáng)性DNA均由本實(shí)驗(yàn)保存。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果 所有樣本檢測(cè)結(jié)果如表1所示，犬糞樣本：石渠縣、爐霍縣、甘孜縣、天全縣和寶興縣包蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為 3.9%、38.1%、27. 8%、100%、6.1%和8.2%，總陽(yáng)性率為12.4%；土壤樣本：石渠縣A鄉(xiāng)、石渠縣B鄉(xiāng)、爐霍縣和色達(dá)縣陽(yáng)性率分別為 15.0%、14.3%、20.0%和0，總陽(yáng)性率為13.1%；犬毛樣本：石渠縣A鄉(xiāng)和石渠縣B鄉(xiāng)陽(yáng)性率分別為10.0%和5.3%，總陽(yáng)性率為7.7%；所有水體樣本均為陰性。

表1 環(huán)境中所采集的樣本信息及檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物的特異性 通過(guò)熔解曲線分析，所有陽(yáng)性樣本的熔解峰均與陽(yáng)性對(duì)照吻合，且均為單峰，說(shuō)明整個(gè)PCR反應(yīng)特異性好，產(chǎn)物均為目的基因產(chǎn)物，無(wú)非特異性產(chǎn)物。

3 討論

四川省甘孜州和阿壩州全州、雅安市的寶興縣和天全縣、涼山州的木里縣和越西縣是包蟲(chóng)病流行區(qū)域，其中甘孜州、阿壩州的部分地區(qū)屬于重度流行區(qū)。尤其是甘孜州的石渠縣，是全世界包蟲(chóng)病研究中心，同時(shí)也是最嚴(yán)重的地區(qū)，而寶興縣、天全縣、木里縣和越西縣均屬于輕度流行區(qū)。

犬糞便中的蟲(chóng)卵是感染人和動(dòng)物的唯一階段，感染途徑主要是犬糞污染環(huán)境，包括土壤、水源以及犬體表的被毛等，人和動(dòng)物通過(guò)直接接觸犬糞以及上述被犬糞污染的環(huán)境，經(jīng)口攝入蟲(chóng)卵導(dǎo)致感染。由于包蟲(chóng)蟲(chóng)卵已在體內(nèi)發(fā)育成熟，排出犬體外就已經(jīng)具有感染性，而且對(duì)低溫具有很強(qiáng)抵抗力，所以一旦犬糞污染周圍環(huán)境，很容易造成人和動(dòng)物感染包蟲(chóng)。造成犬糞污染環(huán)境主要有以下因素：(1)當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)包蟲(chóng)病認(rèn)識(shí)及重視程度低，犬只不經(jīng)常拴養(yǎng)，導(dǎo)致犬糞污染居住地周邊環(huán)境；(2)夏季牧場(chǎng)時(shí)期，犬只需保護(hù)家畜免遭狼、狐貍捕食，必須自由活動(dòng)，無(wú)法拴養(yǎng)；(3)當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)犬糞無(wú)法進(jìn)行有效處理: 高原地區(qū)地廣人稀，居住分散，很難做到犬糞的統(tǒng)一回收、消毒和處理，因此犬糞長(zhǎng)時(shí)間暴露于外界環(huán)境中。據(jù)報(bào)道，在波蘭，從當(dāng)?shù)胤N植的蔬菜表面、野生蘑菇及土壤中均檢測(cè)出了多房棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵DNA[8-10]。犬糞中的蟲(chóng)卵粘附于犬被毛，也是造成人感染的一個(gè)重要途徑。川西北地區(qū)的甘孜州和阿壩州大部分地區(qū)犬只數(shù)量眾多，以甘孜州石渠縣為例，目前登記在冊(cè)的犬只大約2萬(wàn)只左右，家家養(yǎng)犬，人與犬接觸頻繁，尤其是兒童，在與犬接觸玩耍后未能馬上洗手，很容易將犬體表被毛上的蟲(chóng)卵攝入口中，造成感染。2017年9月本人在石渠縣德榮瑪鄉(xiāng)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，就有6～12歲兒童感染包蟲(chóng)的病例。另?yè)?jù)報(bào)道，在哈薩克斯坦，1988-1995年期間，包蟲(chóng)發(fā)病率在1.4人/10萬(wàn)，但從1997-2000年增長(zhǎng)到了3.5～8.3人/10萬(wàn)，其中29%的患者是年齡14歲以下的兒童[11]。犬糞也可能污染地表水源，但在本研究中所有水體樣本均未檢出包蟲(chóng)蟲(chóng)卵，原因可能是水源中即使被污染蟲(chóng)卵，數(shù)量也很少，加之每份樣本量只有50 mL，很難富集到蟲(chóng)卵。因此，對(duì)地表水源中蟲(chóng)卵的檢測(cè)可能需要設(shè)計(jì)專門(mén)的過(guò)濾裝置，前期對(duì)大量水體進(jìn)行過(guò)濾，富集蟲(chóng)卵，才有可能檢出。本試驗(yàn)中采用的熒光PCR方法，特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠同時(shí)檢出細(xì)粒和多房棘球絳蟲(chóng)，尤其適合復(fù)雜樣本(犬糞、土壤)中目的基因的檢測(cè)，而且對(duì)ELISA陰性/陽(yáng)性樣本復(fù)核率高，不存在漏檢和假陽(yáng)性，非常適合后期環(huán)境中蟲(chóng)卵的持續(xù)監(jiān)測(cè)。

寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵普遍具有堅(jiān)固的外殼，除對(duì)外界不良環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性外，還對(duì)常規(guī)的消毒劑具有很強(qiáng)的抵抗力，如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的卵囊在次氯酸鈉溶液中浸泡0.5 h，對(duì)其活力及感染性無(wú)明顯影響。由于包蟲(chóng)蟲(chóng)卵污染的均為自然環(huán)境，如土壤、草地、犬的被毛等，存在大量易與消毒劑發(fā)生反應(yīng)的有機(jī)物，導(dǎo)致消毒效果大大降低，無(wú)法達(dá)到殺滅蟲(chóng)卵的效果。因此，后期迫切需要篩選合適的消毒劑，用于高原地區(qū)環(huán)境中蟲(chóng)卵的殺滅，以確保人和家畜的安全，提高當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生水平。

綜上所述，本研究在犬糞、土壤及犬毛樣本中均檢出了包蟲(chóng)蟲(chóng)卵DNA，說(shuō)明當(dāng)?shù)鼐用癫糠殖潭壬洗嬖趶沫h(huán)境中感染包蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)從2015年開(kāi)始，投入大筆專項(xiàng)資金，全面開(kāi)展包蟲(chóng)病防控工作，包括犬只管理與驅(qū)蟲(chóng)、牛羊免疫、草原鼠害治理以及包蟲(chóng)病宣傳教育等措施，取得了顯著效果。在此基礎(chǔ)上，如能進(jìn)一步開(kāi)展環(huán)境中包蟲(chóng)蟲(chóng)卵的持續(xù)監(jiān)測(cè)，將為進(jìn)一步降低人和動(dòng)物感染包蟲(chóng)風(fēng)險(xiǎn)，以及完善包蟲(chóng)病防控體系提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)支持。