羅婷婷，楊 明，熊小平，樊淑宏，畢祿莎，付曉蕓，徐小平

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041;2.四川省體育科學(xué)研究所，四川 成都 611731)

0 引 言

黃酮類化合物和角鯊烯是近年來食藥領(lǐng)域特別關(guān)注的天然組分，其中黃酮類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)，廣泛分布于植物界中，主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、查爾酮、異黃酮等。由于其獨特的多酚結(jié)構(gòu)，黃酮類化合物具有良好的生理活性，如清除自由基，抗氧化的作用[1]。臨床上常用于改善和治療心血管疾病，降低血脂及膽固醇，抑制血栓等作用[2]。文獻表明黃酮類能增強抗生素的抗菌活性[3]，抗自由基、提高機體免疫力和阻止脂質(zhì)過氧化[4-5]。與己烯雌酚結(jié)構(gòu)的相似性使其具有雌性激素樣作用,俗稱“植物雌激素”，可使甲狀腺 C 細胞分泌降鈣素的作用加強[6]。由此，食用植物油中的一定含量的黃酮組分將對改善心腦血管疾病和機體的保健具有重要的意義。

角鯊烯是一種高度不飽和的直鏈三萜烯類化合物，最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，因此又名為魚肝油萜、鯊烯、鯊萜，角鯊烯含有 6 個非共軛雙鍵，具有較強的抗氧化活性[7]，能夠提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，并具有增強機體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗菌等多種生理功能[8]。角鯊烯能夠抑制致癌物亞硝胺的生成，抑制腫瘤細胞的生長，增強機體免疫力，從而增強對腫瘤的抵抗力[9]。將角鯊烯用于化妝品中可以防止皮膚水分散失，抵御紫外線對皮膚造成的傷害[10]。角鯊烯在植物界中分布廣泛，主要存在于植物的根、莖、葉和種子等部位，尤其是種子油中，角鯊烯的含量相對較高[11]。

有不少關(guān)于植物油中黃酮類化合物和角鯊烯的報道，但大多針對某一特定植物油品的個別指標(biāo)，而多種植物油中黃酮類或角鯊烯的系統(tǒng)檢測尚未見報道。常見的植物油中黃酮的檢測方法有UV法、HPLC 法；角鯊烯常用 GC 法[12-15]、GC/MS法[16-21]和HPLC法[22-28]。其中UV法專屬性較差，HPLC法分析時間較長。GC法分析角鯊烯的穩(wěn)定性不如HPLC，為此本文借助UPLC的超高效、高分辨和穩(wěn)定等特點，以楊梅素、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素5種常見活性黃酮為目標(biāo)，擬建立植物油中黃酮定量的UPLC分析法；擬建立皂化前處理植物油后再UPLC法檢測角鯊烯分析法。分別對13種植物油中的黃酮和角鯊烯進了分布研究?？蔀槭秤弥参镉偷馁|(zhì)量監(jiān)控和油品分級提供黃酮和角鯊烯分析方法和質(zhì)控依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器設(shè)備與耗材：Acquity超高效液相色譜儀，Acquity UPLC BEH C8色譜柱，Acquity UPLC BEH C18色譜柱（美國Waters公司）；XS205電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）；移液器（德國Eppendorf公司）；渦旋混合器（美國Thermo fisher scientific公司）；MTN-2800D氮氣吹干儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Milli-Q公司）；5430離心機（德國Eppendorf公司）。

試劑及材料：角鯊烯（95%，哥倫比亞Matrix Scientific公司）；木犀草素，槲皮素，異鼠李素(98%，四川省維克奇生物技術(shù)有限公司)；山萘酚(98.5%，Chengdu 普思生物)，楊梅素 (98%，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇，正己烷，乙腈（色譜純，美國Dikma公司）；氫氧化鉀、磷酸（86%，成都聯(lián)禾化工醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；小麥胚芽油、橄欖油、青刺果油、火麻籽油、沙棘油、亞麻籽油、牡丹籽油、山茶籽油、葡萄籽油、杏仁油、月見草油、紫蘇油、清脈油（均由成都悟道科技有限公司提供）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

2.1.1 黃酮類

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相 A 為甲醇，B 相為 0.8%的磷酸，梯度洗脫條件如表1所示。檢測波長：360 nm；流量：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 角鯊烯測定條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C8（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-水（97:3），流量為0.25 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。

表1 黃酮類物質(zhì)含量測定流動相梯度程序

2.2 樣品前處理

2.2.1 黃酮類

在樣品制備中，黃酮類化合物具有難溶于水、易溶于甲醇的理化性質(zhì)；因具有酚羥基結(jié)構(gòu)而呈酸性，可溶于堿性水液；具有微弱的堿性，可與強無機酸如濃硫酸、鹽酸等生成鹽，但極不穩(wěn)定，加水易分解[29-30]。為此，分別從4個方面考察提取凈化方法，結(jié)果見表2?？梢钥闯黾状贾苯虞腿⌒瘦^弱，正己烷反萃不理想，濃縮后仍然出現(xiàn)殘留油跡不易吹干，相比之下，方法4采用70%的甲醇經(jīng)加熱振搖萃取[31-32]，離心，上清液揮干，檢出效率最高，最后確定為本法的供試品制備方法。

表2 供試品預(yù)處理方法的比較

2.2.2 角鯊烯

角鯊烯屬于植物油中非皂化部分，因此其提取過程需要皂化。為了考察不同堿液濃度、不同皂化溫度以及不同皂化時間對角鯊烯提取效率的影響，以紫蘇油為研究對象，設(shè)計了關(guān)于這3個因素的正交試驗，結(jié)果表明，最佳皂化條件為：1.5mol/L KOH-C2H6O溶液，于75℃加熱30min。

2.3 溶液配制

1)黃酮類化合物對照品溶液的制備：分別稱取楊梅素、槲皮素、木犀草素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶解于10 mL甲醇中，配制成濃度約為0.5 mg/mL的儲備液備用，精密稱取異鼠李素5 mg溶于50 mL甲醇中，配制成0.1 mg/mL的儲備液備用，用甲醇逐級稀釋，得到所需濃度的對照品溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。對照品色譜圖如圖1所示。

圖1 混合黃酮類物質(zhì)對照溶液色譜圖

2)角鯊烯對照品溶液的制備：稱取一定量角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容于10 mL容量瓶中，配制成濃度約為0.8 mg/mL的儲備液備用，用流動相稀釋至所需濃度，放置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，其色譜圖如圖2所示。

圖2 植物油黃酮含量測定色譜圖

3)黃酮類供試品溶液的制備：精密稱取油樣1.5 g，溶于2 mL 70%的甲醇中，75 ℃水浴加熱1 h，每10 min振搖一次，取出冷卻后，于6000 r/min條件下離心10 min，取上清液1 mL，氮氣吹干，用1 mL流動相溶解，0.22 μm膜過濾，待測，其色譜圖如圖3所示。

圖3 角鯊烯對照溶液色譜圖

4)角鯊烯供試品溶液的制備：稱取0.5 g樣品于試管中，加入5 mL KOH-C2H6O溶液，振搖，于一定溫度下水浴加熱，取出后加入5 mL水，用5 mL正己烷分兩次提取，渦旋1 min，靜置，取上清液，合并后加入5 mL水，振蕩，洗去正己烷中的鹽，于6 000 r/min離心6 min，取1 mL上清液，氮氣吹干，用1 mL乙腈溶解，0.22 μm膜過濾，待測，其色譜圖如圖4所示。

圖4 13種植物油角鯊烯含量測定色譜圖

3 結(jié)果與討論

3.1 專屬性試驗

3.1.1 黃酮類

分別取空白基質(zhì)（除不加樣品外其過程與樣品處理過程相同）以及含有黃酮類物質(zhì)的4種植物油樣品，按照優(yōu)化的色譜條件進行測定。由黃酮類化合物的專屬性測定結(jié)果表明，空白基質(zhì)在主峰位置處不出峰，對本品的含量測定不干擾，如圖2所示。

3.1.2 角鯊烯

分別取空白基質(zhì)（除不加樣品外其過程與樣品處理過程相同）以及13種植物油樣品，按照優(yōu)化的色譜條件進行測定。由角鯊烯的專屬性測定結(jié)果表明，空白基質(zhì)在主峰位置處不出峰，對本品的含量測定不干擾，如前文中圖4所示。

3.2 線性范圍、檢測限與定量限

3.2.1 黃酮類化合物

精密量取楊梅素、槲皮素、木犀草素、山奈酚以及異鼠李素對照品儲備液適量，加流動相逐級稀釋成濃度分別為 50，100，200，300，500，600 ng/mL的混合黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)液相色譜測定。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的黃酮主峰的峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，分別得到5個黃酮類化合物的線性方程及其檢出限和定量限。結(jié)果如表3所示?？梢钥闯鲈诟鼽S酮的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，檢測限在10.1～15.6 ng/mL，定量限在 33.6～48.6 ng/mL。

表3 混合黃酮類物質(zhì)線性方程

3.2.2 角鯊烯

精密量取角鯊烯對照品儲備液適量，加流動相逐級稀釋為 1，5，10，15，20，100，350 μg/mL 的梯度角鯊烯系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)液相色譜測定，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的角鯊烯主峰峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得角鯊烯的線性方程，及其檢出限和定量限。結(jié)果如表4所示。可以看出在各個角鯊烯的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（y=101 350x+445 344，r=0.999 8），檢測限 27.3 ng/mL，定量限為81.9 ng/mL。

3.3 回收率試驗

3.3.1 黃酮類

黃酮類化合物以不含黃酮的紫蘇油為空白，取5種樣品9份各1.5 g，均分成3組，分別加入濃度為 600，500，400 μg/mL的 5種黃酮混合對照品溶液，按照2.3的樣品溶液制備方法制備，進樣測定，結(jié)果如表5。由表中回收率試驗結(jié)果表明，該5種黃酮的平均加樣回收率在97.75%～102.2%，表現(xiàn)出良好準(zhǔn)確性。

表4 角鯊烯提取正交試驗結(jié)果

表5 黃酮類物質(zhì)回收試驗結(jié)果

3.3.2 角鯊烯

分別精密稱取杏仁油（72.12 μg/g）9份各 0.5 g，均分成 3組，分別加入 645，818，980 μg/mL 對照品濃度的角鯊烯對照溶液，按照4.3.2項下條件處理，進樣測定，結(jié)果如表6。由表中結(jié)果表明，角鯊烯的平均加樣回收率為88.18%。

3.4 精密度試驗

3.4.1 黃酮類

取400 μg/mL的混合黃酮類物質(zhì)對照品溶液，重復(fù)進樣6次，以峰面積計算進樣精密度；以6份沙棘油分別制成的供試品溶液，重復(fù)測定，以各黃酮組分的含量計算得重復(fù)性精密度；取上述沙棘油供試品溶液一份，分別由兩組人員連續(xù)測定6 d，由測得的個黃酮的含量計算中間精密度，結(jié)果如表7所示?？梢钥闯鲞M樣精密度的RSD為0.86%～1.52%；重復(fù)性精密度的RSD為2.79%～7.75%；6 d內(nèi)的中間精密度RSD為2.25%～14.49%，表現(xiàn)出本方法進樣精密度、重復(fù)性精密度良好，含量越低，對精密度的影響越明顯，其中，中間精密度的楊梅素的精密度較差。

表6 角鯊烯含量測定回收率試驗結(jié)果

表7 植物油中黃酮檢測的精密度試驗結(jié)果

3.4.2 角鯊烯

取適當(dāng)濃度的角鯊烯對照品溶液，重復(fù)進樣6次，以主峰峰面積計算進樣精密度；取6份杏仁油分別制成供試品溶液，重復(fù)測定，以測定的角鯊烯含量計算重復(fù)性精密度；取上述杏仁油供試品溶液一份，分別由兩組人員連續(xù)測定，以測定角鯊烯的含量計算得中間精密度。由表8可知，進樣精密度的RSD為0.2%；重復(fù)性和中間精密度的RSD分別為1.96%和3.0%，表現(xiàn)出方法的精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗

取沙棘油供試品溶液，分別于 0，1，2，4，8，12，24 h 測定黃酮和角鯊烯的含量，以確定不同時間供試品溶液中黃酮的降解情況。結(jié)果表明樣品在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4 實際樣品的測定

4.1 黃酮類

由表9可知，13種植物油中，只有部分檢測出黃酮，其中火麻籽油和沙棘油均檢測出楊梅素、槲皮素、木犀草素、山奈酚以及異鼠李素這5種黃酮類組分，橄欖油中檢出木犀草素和異鼠李素；亞麻籽油中木犀草素和槲皮素；其余小麥胚芽油、青刺果油、牡丹籽油、等9種植物油中未檢測到這5種黃酮類組分。這種分布現(xiàn)象提示是否與黃酮的極性較大有關(guān)，從而體現(xiàn)出植物油的生產(chǎn)工藝是壓榨工藝還是提取工藝，當(dāng)采用壓榨工藝時，黃酮存在可能性較大，而提取型植物油則黃酮因極性影響不易被提取，由此，黃酮的含量或許可以用以區(qū)分兩種工藝的質(zhì)控指標(biāo)。

表8 角鯊烯含量測定方法進樣精密度、重復(fù)性、中間精密度結(jié)果試驗結(jié)果

表9 植物油中黃酮類物質(zhì)含量測定結(jié)果1)（n=3） μg/g

表10 植物油中角鯊烯含量測定結(jié)果1)（n=3）

4.2 角鯊烯

植物油中角鯊烯的測定結(jié)果如表10所示，大部分植物油中角鯊烯含量相差不大，都不超過100 μg/g。山茶籽油、沙棘油以及亞麻籽油中角鯊烯含量較少，分別只有 27.75 μg/g 、20.45 μg/g 以及 24.49 μg/g。小麥胚芽油、青刺果油、火麻籽油、牡丹籽油、葡萄籽油、杏仁油、月見草油以及紫蘇油、清脈油中角鯊烯含量相差不大，為60～100 μg/g。而橄欖油中的角鯊烯含量以遠遠超出其他植物油的數(shù)值高居第一，達到2 302.11 μg/g，是其他植物油中角鯊烯含量的40倍左右。

5 結(jié)束語

總之，本文所建UPLC分析為實現(xiàn)多種植物油中的黃酮和角鯊烯的分布情況提供了高效、靈敏、快速的分析方法，為植物油質(zhì)量的提高提供了一定的方法依據(jù)。在所檢測的13種食用植物油中，只有火麻籽油和沙棘籽油能正常檢出，橄欖油和亞麻籽油檢出較少，而其他的油均未檢出，甚至清脈油作為其余12種油的混合也沒能檢測出黃酮類化合物，提示提取油可能是目前的主要工藝。13種食用植物油中所檢測的角鯊烯則全部檢出，其中橄欖油中的角鯊烯含量尤為高，是其他植物油中角鯊烯含量的40倍左右，沙棘籽油和亞麻籽油中的角鯊烯含量則相對較小，但檢出值也相當(dāng)可觀，說明建立的UPLC方法對食用植物油中角鯊烯的檢測有效可行。由UPLC對文中黃酮和角鯊烯兩種活性成分所建立的檢測方法行之有效，也可能適用于植物油中其他重要活性成分的檢測。