劉剛， 杜悠雯， 張璐， 劉曉穎

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230032)

線粒體是真核生物進(jìn)行有氧呼吸的主要部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化并釋放能量的場(chǎng)所，線粒體正常生理生化功能的行使離不開線粒體中的各種酶[1]。在線粒體中，一些具有代表性的酶對(duì)線粒體正常功能的實(shí)現(xiàn)起到關(guān)鍵作用，這些酶不僅能夠維持線粒體的正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)，還與細(xì)胞呼吸作用及ATP的合成密切相關(guān)[2-4]。線粒體酶在細(xì)胞生理生化過(guò)程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，其結(jié)構(gòu)和功能的正常與否對(duì)細(xì)胞、組織乃至整個(gè)機(jī)體正常功能的維持具有相當(dāng)重要的作用[5-6]。

線粒體是細(xì)胞對(duì)外來(lái)物質(zhì)反應(yīng)最敏感、最早出現(xiàn)損傷的細(xì)胞器，研究表明，線粒體是許多環(huán)境毒物尤其重金屬作用的優(yōu)先靶標(biāo)[7-9]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代工、農(nóng)業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的重金屬被排放到環(huán)境中，重金屬能夠影響與線粒體電子傳遞和氧化呼吸作用密切相關(guān)的酶，通過(guò)改變酶的結(jié)構(gòu)，或與起輔酶作用的金屬發(fā)生置換反應(yīng)，致使其活性減弱甚至喪失，進(jìn)而導(dǎo)致影響氧化磷酸化效率及ATP的合成效率，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者壞死[10]。研究表明在重金屬鉬的作用下，小鼠肝臟線粒體中的SDH酶活性受到明顯抑制，且隨著鉬濃度的增加酶的活性逐漸減弱[10-11]。鎘對(duì)華溪蟹線粒體中的SDH、NADH氧化酶活力均隨著濃度的增加先升后降[11]。高濃度鎘短期暴露能夠降低黃顙魚鰓線粒體ATP酶的活性，鉛離子能夠使家蠶幼蟲脂肪體中的GST酶與GSH-PX酶的活性顯著升高，染鎘后大鼠線粒體內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力明顯下降，進(jìn)一步加劇膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷[12]。

鉛是一種古老的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，使用普遍且不可降解，工業(yè)生產(chǎn)排放的鉛以各種形式在環(huán)境中不斷積累與放大，造成低濃度、長(zhǎng)時(shí)間、持續(xù)的污染，對(duì)各種生物產(chǎn)生毒害作用，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)巨大的危害。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的鉛被排放到環(huán)境中，鉛污染已經(jīng)成為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題[13]。肝臟比其他組織器官對(duì)Pb2+更敏感，Pb2+侵入機(jī)體后使肝細(xì)胞中的線粒體及其蛋白質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化功能產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的傷害，引起線粒體內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的破壞，造成相關(guān)線粒體蛋白的表達(dá)異常，影響到線粒體的生理功能，導(dǎo)致或促進(jìn)細(xì)胞損傷的發(fā)生[13-14]。近年來(lái)，重金屬對(duì)線粒體及其蛋白質(zhì)毒性作用機(jī)制的研究雖然取得一些進(jìn)展，但還存在許多有待解決的問題。本研究擬以重金屬鉛脅迫下的小鼠肝臟線粒體酶為研究對(duì)象，探究不同濃度Pb2+脅迫下線粒體酶活性特點(diǎn)，旨在全面評(píng)價(jià)重金屬對(duì)線粒體酶的毒性效應(yīng)，揭示重金屬對(duì)線粒體的損傷機(jī)制，以期為重金屬污染的預(yù)防與治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與處理

供試小鼠為成年健康昆明種小鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)提供，雌雄各半，個(gè)體質(zhì)量為22.00 g±3.00 g，在溫度為20℃～25℃的條件下觀察飼養(yǎng)1周。按SAS隨機(jī)分組程序?qū)?5只小鼠隨機(jī)分為7組(每組5只)，分別為對(duì)照組、50、100、200、300、400和500 mg/kg硫酸鉛染毒組。染毒組分別經(jīng)口灌胃相應(yīng)濃度的硫酸鉛溶液，對(duì)照組經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)體積的高純水，共給藥30 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每只小鼠單籠飼養(yǎng)，各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，實(shí)驗(yàn)期間密切觀察各組小鼠的情況，給藥30 d后脫臼處死小鼠。

1.2 線粒體提取

處死的小鼠迅速剖開腹腔取出肝臟，浸入預(yù)冷的沖洗液(0.01 mol/L PBS pH 7.4，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF)中沖洗，輕輕用濾紙吸干后轉(zhuǎn)至冰上燒杯；參照細(xì)胞線粒體分離試劑盒提取、純化各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟線粒體，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶活性測(cè)定

在線粒體沉淀物中加500 μL勻漿液，混勻后按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒操作方法分別測(cè)定SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX等5種酶的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的癥狀

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較低濃度的鉛離子實(shí)驗(yàn)組(50和100 mg/kg)和陰性對(duì)照組(0 mg/kg)小鼠在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)明顯異常現(xiàn)象，精神狀態(tài)和食欲沒有受到明顯的影響；中濃度實(shí)驗(yàn)組(200、300 mg/kg)小鼠在一周后出現(xiàn)輕微的食欲下降；而高濃度實(shí)驗(yàn)組(400、500 mg/kg)小鼠在一周后出現(xiàn)明顯的食欲下降，精神沉郁。小鼠剖檢觀察組織器官顯示，低鉛組小鼠與對(duì)照組相似，無(wú)明顯癥狀；而高鉛組小鼠肝臟呈現(xiàn)明顯的暗紅色，且體積增大。

2.2 鉛對(duì)小鼠肝臟線粒體5種酶活力的影響

經(jīng)Pb2+暴露處理后，小鼠肝臟線粒體的SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX等5種酶的活力均呈下降趨勢(shì)。在各染毒組中，50 mg/kg染毒組與對(duì)照組相比，5種酶的活性略低于對(duì)照組，分別下降了14.64%、15.90%、17.87%、11.87%和16.48%，其中下降率最高的為GST(17.87%)，最低的為ATP酶(14.64%)。而濃度最高的500 mg/kg染毒組，與對(duì)照組相比，各組酶的活性分別下降了74.59%、71.49%、60.00%、50.65%和70.68%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Pb2+濃度的增加，小鼠肝臟線粒體5種酶的活性都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在500 mg/kg染毒組，酶活性下降至最低點(diǎn)，較對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，具體見表1和圖1。

通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 5種酶的活力隨著鉛離子脅迫濃度的增加均呈逐漸下降趨勢(shì)。各實(shí)驗(yàn)組酶活性與鉛離子濃度呈明顯負(fù)相關(guān)性，隨著鉛離子濃度的增加，各酶的活性逐漸下降(圖2)。

圖1 不同濃度Pb2+脅迫下小鼠肝臟SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 等5種酶活性分析

圖2 Pb2+濃度與小鼠肝臟SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 等5種酶活性相關(guān)性分析

3 討論

鉛是環(huán)境中廣泛存在的重金屬污染物之一，環(huán)境中暴露的鉛一旦進(jìn)入機(jī)體后可與蛋白質(zhì)或酶分子中許多基團(tuán)結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)，從而影響體內(nèi)酶的生物活性，引起一系列生理生化的異常，嚴(yán)重影響機(jī)體的功能[15]。Pb2+可以與線粒體呼吸鏈上的酶蛋白相結(jié)合，影響線粒體內(nèi)膜系統(tǒng)的質(zhì)子泵功能，阻斷線粒體氧化磷酸化，影響能量的生成；同時(shí)，Pb2+也能破壞細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或引起組織、器官的病變[7-9, 16-17]。Pb2+對(duì)生物體有很強(qiáng)的毒性，其能損害多種組織和器官。實(shí)驗(yàn)研究表明醋酸鉛對(duì)小鼠的LD50為10 562 mg/kg，持續(xù)、低濃度的鉛暴露不會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，小鼠體質(zhì)量隨醋酸鉛劑量的增加變化不明顯，但對(duì)小鼠大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟均具有一定的急性毒性效應(yīng)，且小鼠病理組織變化明顯，故本研究染毒組最高濃度為500 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX的酶活性與鉛離子濃度呈負(fù)相關(guān)性，隨著鉛離子濃度的增加，5種酶的活性逐漸下降，與重金屬鎘脅迫下的水生生物酶活性相比，略有差異[18, 22]。

作為新陳代謝最旺盛的器官，肝臟細(xì)胞中線粒體所占的比例較大，NADH和SDH與線粒體電子傳遞鏈密切相關(guān)，可以反映出有氧呼吸的強(qiáng)弱，間接體現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化，是線粒體呼吸鏈的標(biāo)志酶。NADH是呼吸鏈中的第一個(gè)質(zhì)子泵，推動(dòng)H+跨過(guò)線粒體內(nèi)膜到線粒體基質(zhì)與細(xì)胞溶膠相接觸，由此而形成的電化學(xué)梯度即質(zhì)子動(dòng)力驅(qū)動(dòng)ATP合酶合成ATP，促進(jìn)氧化磷酸化反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)[18]。SDH可以將檸檬酸循環(huán)中的琥珀酸氧化為延胡索酸，是細(xì)胞有氧呼吸-檸檬酸循環(huán)的關(guān)鍵酶[19-20]。ATP酶又稱為三磷酸腺苷酶，是一類能將三磷酸腺苷(ATP)催化水解為二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子(Pi)的酶，在該生化反應(yīng)中釋放出大量的能量。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著Pb2+濃度的增加，導(dǎo)致線粒體內(nèi)與有氧呼吸有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致其活性降低，電子傳遞受阻，氧化磷酸化合成出現(xiàn)障礙，最終導(dǎo)致能量代謝的衰竭。

表1 不同Pb2+濃度下小鼠肝臟SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 5種酶活性值

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)是生物體內(nèi)重要的解毒酶。GST酶是重要的解毒酶系之一，能利用還原性谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的還原作用參與解毒反應(yīng)和修復(fù)細(xì)胞的氧化損傷，GSH-PX在細(xì)胞內(nèi)能消除有害過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，保持細(xì)胞內(nèi)自由基的平衡，具有保護(hù)細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)和功能的作用[21-22]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)Pb2+劑量達(dá)到一定量時(shí)能顯著降低小鼠肝臟線粒體GST和GSH-PX活力，當(dāng)Pb2+濃度升高至500 mg/kg時(shí)，兩種酶的活性降到最低，與對(duì)照組相比出現(xiàn)極顯著差異(表1和圖1)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，重金屬鉛暴露能導(dǎo)致小鼠肝臟組織線粒體SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 5種酶活性的降低，這為今后進(jìn)一步探討重金屬暴露對(duì)肝臟線粒體標(biāo)志酶毒性影響的確切機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。至于鉛降低小鼠肝臟線粒體酶活力的機(jī)制，還有待于進(jìn)一步探討。