孫海宏，王 芳，葉廣繼

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海西寧810016;2.青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810016)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是茄科茄屬的一年生草本植物，糧菜兼用，在世界上種植范圍廣，抗旱，耐瘠薄，是繼水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。其抗病、抗寒、抗旱、早熟性、豐產(chǎn)性等優(yōu)良性狀的選育一直備受關(guān)注。馬鈴薯現(xiàn)有的栽培種遺傳背景狹窄，親緣關(guān)系近，后代變異僅停留在近交水平，所以常規(guī)育種很難選育出優(yōu)良抗性品種［1］。在馬鈴薯的野生種中含有大量的抗病基因和特殊基因，這為馬鈴薯育種提供了豐富的基因庫［2］。然而，生產(chǎn)上應(yīng)用的普通馬鈴薯基本為四倍體，野生種為二倍體，由于胚乳平衡數(shù)(EBN)的差異，很多野生種與栽培種存在雜交障礙，常規(guī)育種技術(shù)不能滿足現(xiàn)在的育種需要。利用體細(xì)胞雜交技術(shù)可以克服馬鈴薯栽培種和野生種間由于倍性不同引起的生殖隔離，將野生種的優(yōu)良基因?qū)朐耘喾N以改良品種性狀［3］。馬鈴薯原生質(zhì)體融合培養(yǎng)是利用細(xì)胞雜交技術(shù)進(jìn)行育種的基礎(chǔ)。但所用材料的基因型不同，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)的結(jié)果存在差異。影響原生質(zhì)體融合培養(yǎng)的因素主要包含基因型、培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基組成等［4－5］，馬鈴薯野生種 Solanum pinnatisectmum有豐富的抗性基因，包括高抗晚疫病(PVX、PVY、PLRV)和抗病毒病等，栽培種下寨65是青海省主栽品種，但該品種極易感染晚疫病。本試驗(yàn)通過對(duì)影響原生質(zhì)體融合、培養(yǎng)的相關(guān)因素進(jìn)行研究，旨在獲得一種穩(wěn)定的適合于馬鈴薯野生種Solanum pinnatisectmum與栽培種下寨65試管苗葉片的原生質(zhì)體分離融合培養(yǎng)體系，為馬鈴薯野生種及與栽培種之間的體細(xì)胞雜交奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 融合親本原生質(zhì)體的分離純化與活力檢測(cè)

選用青海省農(nóng)林科學(xué)院青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的馬鈴薯野生種Solanum pinnatisectmum和下寨65無菌苗，通過單節(jié)切段擴(kuò)繁于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng);取培養(yǎng)21 d左右的試管苗上部充分展開的3～4張葉片，于超凈工作臺(tái)中切成3 cm左右寬的細(xì)長條帶放入10 mL酶解液中。酶解液成分:纖維素酶(OnozukaR－10)、果膠酶(Y－23)、離析酶(OnozukaR－10)、3 mmol/L MES［2－(N －嗎啉)乙磺酸］、2%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0.2%BSA、0.35 mol/L甘露醇。將含有葉片的酶解液置于25℃、40 r/min的恒溫?fù)u床中黑暗解離12～14 h(本研究所用培養(yǎng)基均參照周宇波等的基礎(chǔ)配方［6］，不再列出)。

酶解液用100目的尼龍膜過濾到10 mL離心管中，于600 r/min離心5 min，棄上清液，緩慢加入2 mL MR(含有63.75% 甘露醇)混合均勻后，緩緩加入到有7 mL高濃度蔗糖溶液(含有23%的蔗糖)的10 mL離心管中，600 r/min離心6 min。用微量移液器將液體中環(huán)狀原生質(zhì)體吸出，用MPS再次將其懸浮，600 r/min離心5 min，重復(fù)2次，得到的沉淀物即為純化的原生質(zhì)體。調(diào)整S.pinnatisectmum原生質(zhì)體的終密度為2×105個(gè)/mL左右，用于原生質(zhì)體融合。

原生質(zhì)體活力檢測(cè):采用熒光素雙醋酸酷(FDA)法檢測(cè)原生質(zhì)體活力，F(xiàn)DA先用丙酮制備成0.5%的貯備液，0℃保存?；盍z測(cè)時(shí)，取0.5 mL純化好的原生質(zhì)體，加入10μL FDA使FDA終濃度為0.01%，混勻后置于室溫下5 min。在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)濾光片為QB24，壓制濾光片為JBS。由于葉綠素的存在，有活力的葉肉原生質(zhì)體發(fā)黃綠色熒光。每個(gè)數(shù)據(jù)為10個(gè)視野的平均數(shù)，原生質(zhì)體活力計(jì)算為發(fā)黃綠熒光的原生質(zhì)體數(shù)占原生質(zhì)體總數(shù)的百分率。

1.2 原生質(zhì)體的融合方法研究

1.2.1 化學(xué)融合方法 融合誘導(dǎo)液(FA)的組成為8 mmol/L CaCl2+0.7 mmol/L KH2PO4+25% 聚乙二醇(PEG)，pH 值為5.8，過濾滅菌，4℃下保存?zhèn)溆?，聚乙二醇為PEG－6000。融合固定液(FB)為80 mmol/L CaCl2，溶液pH值為10，高溫滅菌。

融合方法:將純化好的雙親原生質(zhì)體懸浮液(密度約為2×106個(gè)/mL)按1∶1比例混合，用滴管將原生質(zhì)體懸浮液均勻地滴于一無菌的培養(yǎng)皿底部，靜置3 min，在懸浮液頂部加入1滴融合誘導(dǎo)液EA，室溫下靜置15 min，然后在其頂部加入1滴融合固定液FB，再靜置10 min，用MPS培養(yǎng)基漂洗2次，調(diào)整密度培養(yǎng)。

1.2.2 電融合方法 電融合儀為Eppendorf的Multiporator 4308型融合儀，融合室為250μL螺旋型鉑金電極，間距0.2 mm。

電融合液的組成:0.35 mol/甘露醇 +0.2 mmol/L CaCl2，pH值為5.8，高溫滅菌。

將雙親的原生質(zhì)體按1∶1比例混合，用加樣槍吸取245μL細(xì)胞懸浮液小心地加入到融合池底部，操作過程中避免打濕融合池的邊緣及內(nèi)側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡而影響融合效率。將鉑金電極小心地插入融合池中，緩慢旋緊，然后連接到共軸連接頭上，進(jìn)行融合?；救诤蠀?shù)為交變電壓80 V/cm，成串時(shí)間10 s，直流脈沖1 000 V/cm，作用時(shí)間60μs，脈沖1次。

1.3 增殖培養(yǎng)基激素水平的篩選研究

1.3.1 材料 以S.pinnatisectmum和下寨65融合再生的愈傷組織為試驗(yàn)材料。

1.3.2 方法 將約0.1 mm的增大的細(xì)胞團(tuán)從MPScul培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基在0.4 mg/L細(xì)胞分裂素(6－BA)條件下，設(shè)置了3個(gè)NAA濃度處理(表1)。

表1 愈傷增殖培養(yǎng)基中NAA濃度試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 芽分化培養(yǎng)基中的激素濃度搭配試驗(yàn)

1.4.1 材料 以S.pinnatisectmum和下寨65融合再生的愈傷增殖組織為試驗(yàn)材料。

1.4.2 方法 研究前人關(guān)于馬鈴薯愈傷組織芽分化過程中激素使用濃度基礎(chǔ)上，選取直徑大于3 mm的愈傷組織為試驗(yàn)材料，設(shè)置了4種分化培養(yǎng)基(表2)，4個(gè)月時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織的最初芽分化時(shí)間和分化率(最初芽分化時(shí)間指愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上的時(shí)間到初次芽分化的天數(shù)，分化率為每皿能夠分化的愈傷數(shù)占接種總愈傷數(shù)的百分率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)融合方法研究

通過化學(xué)融合和電融合2種融合方式的比較，結(jié)果表明，2種融合方式的細(xì)胞融合率沒有顯著差異，在前期優(yōu)化融合條件和融合參數(shù)的條件下，其最高融合率均在40%以上，但是融合后的原生質(zhì)體培養(yǎng)反應(yīng)存在顯著差異(表3)。電融合的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)迅速，培養(yǎng)后24 h細(xì)胞開始膨大，而PEG融合的細(xì)胞需要48～72 h才開始膨大，培養(yǎng)至第10天時(shí)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的植板率，電融合細(xì)胞的植板率為33.6%，顯著高于化學(xué)融合方式的20.8%。方差分析結(jié)果表明，在愈傷組織分化成苗能力上，電融合的細(xì)胞也顯著強(qiáng)于化學(xué)融合。但是兩者的愈傷組織挑出后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上均生長正常，表現(xiàn)在初次分化成苗的時(shí)間和雜種植株比例上并沒有顯著差異。由此可見，PEG對(duì)細(xì)胞的生長存在一定的抑制作用，集中表現(xiàn)在原生質(zhì)體培養(yǎng)前期。

表2 芽分化培養(yǎng)基中的激素濃度搭配試驗(yàn)

將含有融合細(xì)胞的混懸液滴于3 mm無菌培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿中含有2 mL MPScul培養(yǎng)基，每皿3～4滴)進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，此階段培養(yǎng)時(shí)間約為3周。隨著細(xì)胞的繼續(xù)分裂，可見米白色的“小點(diǎn)”，經(jīng)過14 d培養(yǎng)，一部分細(xì)胞團(tuán)能長成直徑約1 mm的小愈傷。此時(shí)，可以陸陸續(xù)續(xù)將小愈傷組織挑至愈傷增殖培養(yǎng)基上。

表3 不同的融合方式對(duì)原生質(zhì)體融合及培養(yǎng)效果的影響

2.2 增殖培養(yǎng)基激素水平的篩選研究

愈傷組織接種到不同分化培養(yǎng)基上以后，愈傷組織形態(tài)特征表現(xiàn)出差異，只有在B處理(NAA濃度為1 mg/L)上，愈傷組織生長旺盛，進(jìn)一步增大，顏色由淺綠色逐漸變?yōu)轷r綠，而在其他處理的分化培養(yǎng)基上，愈傷組織均生長緩慢，并出現(xiàn)了不同程度的黃化現(xiàn)象(表4)。

表4 愈傷增殖培養(yǎng)基中NAA濃度對(duì)愈傷組織生長的影響

2.3 芽分化培養(yǎng)基中的激素濃度搭配試驗(yàn)

在本試驗(yàn)條件下，愈傷組織的生長速度適中，愈傷組織的狀態(tài)適宜進(jìn)一步分化培養(yǎng)要求，以NAA的濃度為1.0 mg/L配合0.4 mg/L 6－BA，具體結(jié)果見表5所示。結(jié)果表明，雖然4種激素濃度搭配處理都可以誘導(dǎo)馬鈴薯愈傷組織分化，但不同處理間的分化時(shí)間和分化頻率差異顯著。對(duì)于愈傷組織而言，以 B 處理(0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L Zeatin)的誘導(dǎo)分化效果最好，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上生長約60 d時(shí)開始分化形成小芽，平均的分化頻率達(dá)16.7%，顯著好于其他分化處理。

培養(yǎng)過程中還發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織快速增殖階段，馬鈴薯的愈傷組織培養(yǎng)區(qū)別于其他作物，不需要作滲透壓的降壓處理，改變滲透壓反而對(duì)愈傷組織生長不利。

在愈傷中分化出3 mm芽時(shí)將芽切下，移入普通的MS培養(yǎng)基中進(jìn)生根培養(yǎng)成完整植株，親本融合率及倍性分析由流式細(xì)胞儀(Guava EasyCyte 10)進(jìn)行檢測(cè)，形成的六倍體有雙親的染色體組雜種，占總雜種的30%。整個(gè)原生質(zhì)體分離純化及融合培養(yǎng)過程見圖1。

表5 愈傷增殖培養(yǎng)基中不同激素配比對(duì)芽分化的影響

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞融合對(duì)于有雜交障礙親本是一個(gè)非常有用的育種手段，要有目的地選擇親本材料，應(yīng)該多選擇近緣種進(jìn)行原生質(zhì)體融合。但不同基因型之間的融合細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)反應(yīng)有較大差異，本試驗(yàn)是眾多親本組合中篩選出來的容易培養(yǎng)的組合，其細(xì)胞啟動(dòng)分裂較快，培養(yǎng)25～30 d時(shí)可形成直徑達(dá)1 mm的小愈傷組織，繼而可以形成數(shù)量龐大的愈傷組織。能夠分化的愈傷組織初次分化時(shí)間相差不大，約為60 d左右，但表現(xiàn)出較長的持續(xù)分化時(shí)間，往往需要4個(gè)月的時(shí)間，因此，在分化培養(yǎng)基上要定期更換新鮮培養(yǎng)基以保證愈傷組織生長對(duì)營養(yǎng)的需求。愈傷組織增殖階段對(duì)光照強(qiáng)度異常敏感，置于光照條件下，愈傷組織生長緩慢，結(jié)構(gòu)變得異常致密，少量愈傷出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。本研究中，不確定這是2個(gè)親本的最佳融合培養(yǎng)體系，但確定是有效的體系。在今后的原生質(zhì)體融合研究中，將根據(jù)育種目標(biāo)，進(jìn)行更多的親本組合研究，進(jìn)一步改良融合培養(yǎng)體系，更有效將此技術(shù)用于馬鈴薯的育種工作當(dāng)中。