楊宇鴻,董士遠,靳衛(wèi)亞,毛振杰,蘇明月,岳 敏

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

魚肉蛋白具有較高的營養(yǎng)價值,其主要成分為肌原纖維蛋白,具有較強的凝膠性和保水性,但熱穩(wěn)定性和溶解性較差[1]。為了提高蛋白質(zhì)的某些功能性質(zhì),可以對魚肉蛋白進行改性。改性的方法通常有物理法、化學法、酶法。物理改性的設備投入相對大且改性范圍相對窄;傳統(tǒng)的化學改性通常會引入一些化學試劑,其安全性受到質(zhì)疑;酶法的缺點是選擇合適的酶、控制反應條件比較困難,而且酶的價格相對比較昂貴[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),糖基化修飾在一定程度上可克服蛋白質(zhì)遇熱不穩(wěn)定問題,可極大地改善蛋白質(zhì)功能特性,如溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性及抗氧化性等,而且反應過程中不需要化學催化,反應條件簡單,安全性大大提髙。因此,糖基化修飾被認為是改善蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和功能特性的有效手段之一。糖基化反應分為干法和濕法兩種,濕法糖基化反應由于水分含量高、蛋白質(zhì)溶解分散性差、所需的反應溫度相對較高等原因,反應較難控制;而干法糖基化雖工藝過程相對復雜,但反應條件溫和,反應過程比較容易控制,是目前對蛋白質(zhì)進行美拉德反應改性普遍采用的方法[1,3-4]。

目前,國內(nèi)外對于魚肉蛋白的糖基化改性研究主要集中在對鯉魚、鰱魚、羅非魚等肌原纖維蛋白的溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、抗氧化性以及鈣結合能力等方面的研究,如Saeki[5]、Sato等[6]和Fujiwara等[7]分別利用核糖、褐藻寡糖和葡聚糖對鯉魚肌原纖維蛋白進行糖基化改性,發(fā)現(xiàn)糖基化后的肌原纖維蛋白的溶解度、乳化性和熱穩(wěn)定性分別得到了顯著性地提高。陳欣等[8]以葡萄糖、殼聚糖和羧甲基纖維素鈉作為糖基供體對羅非魚肌原纖維蛋白進行干法糖基化反應,發(fā)現(xiàn)糖基化可以提高羅非魚肌原纖維蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性。張愛榮等[9],尤娟等[10],You等[11],Liu等[12]分別以乳糖、低聚異麥芽糖、葡萄糖、魔芋甘露寡糖為糖基供體,與鰱魚肌原纖維蛋白糖基化反應,發(fā)現(xiàn)鰱魚肌原纖維蛋白溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、抗氧化性、鈣結合能力顯著性提高。目前,國內(nèi)外對草魚蛋白的糖基化反應研究,主要集中在制備草魚蛋白酶解液調(diào)味料[13-15],提高草魚肽的抗氧化性[16]以及降低過敏性[17]等,而關于草魚肌原纖維蛋白糖基化反應特性研究及功能改性研究鮮有報道。利用糖基化改性草魚肌原纖維蛋白的乳化性能[1]對提高其在食品中的應用具有重要意義。

本研究以草魚肌原纖維蛋白為原料,系統(tǒng)地分析了不同反應時間對制備的草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物理化特性(包括糠氨酸含量、熒光強度、游離氨基含量、色差值)以及蛋白質(zhì)二級結構、乳化特性的影響。這將為糖基化在草魚肌原纖維蛋白改性中的實際應用提供理論基礎,也為草魚肌原纖維蛋白在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚(2～3 kg/尾) 青島市臺東水產(chǎn)批發(fā)市場;溴化鉀(光譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;糠氨酸標準品 Neosystem Laboratoire公司;鏈霉蛋白酶E(酶活7000 U/g) 北京索萊寶公司;其他試劑(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

GL-21M型高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器公司;LC-20AT型高效液相色譜儀、UV-2250型紫外可見分光光度計 日本島津公司;F-4600型熒光分光光度計 日本島津公司;Nicolet IS10型傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技有限公司;HP-200型精密色差儀 上海澳程檢測儀器有限公司;IKA T18 basic型高速分散均質(zhì)機 德國IKA儀器設備有限公司;超濾離心管(3 kDa) Amicon?Ultra-15。

1.2 實驗方法

1.2.1 草魚肌原纖維蛋白的提取 草魚肌原纖維蛋白的提取采用Liu等[18]的方法。新鮮草魚去頭、去尾、去內(nèi)臟后,取其背脊肉凍藏于-20 ℃以待備用。取一定質(zhì)量的草魚肉,加入10倍體積預冷的50 mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液,勻漿,浸提30 min后離心(4 ℃,8000 r/min,10 min)取其沉淀,重復上述步驟2次。將得到的沉淀加入10倍體積50 mmmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L的KCl),勻漿2 min,攪拌浸提12 h,浸提液于4 ℃、8000 r/min離心10 min,取上清液加入3倍體積(v/v)預冷的蒸餾水,攪拌30 min后離心(4 ℃,8000 r/min,10 min),然后將沉淀冷凍干燥(真空度:1.3～13 Pa,冷阱溫度:-10～-50 ℃)即得草魚肌原纖維蛋白。上述所有操作均在4 ℃以下進行。

1.2.2 草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物制備 參考Han等[19]的方法制備草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物。草魚肌原纖維蛋白與葡萄糖按1∶2(w/v)的比例分散于0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖溶液中,均質(zhì)混勻后,冷凍干燥得到干粉。稱取一定量的凍干粉進行干熱糖基化反應,相對濕度保持在44%,溫度為50 ℃,分別于0、6、12、24、48、72、96、168 h時取樣,制備草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物。將得到的反應樣品配制成濃度為5 mg/mL水溶液。加入超濾離心管中,6000 r/min條件下,于4 ℃離心20 min進行脫糖,重復3次上述步驟(苯酚硫酸法檢測上清液中無葡萄糖檢出)后,得到的沉淀分散于蒸餾水中冷凍干燥。

1.2.3 糠氨酸含量的測定 參照Amigobenavent等[20]的方法。稱取反應樣品于安瓿瓶中,加入一定體積的9 N HCl,使其終濃度為6.25 mg/mL,充氮1 min,用酒精噴燈進行高溫封口。隨后在110 ℃條件下,水解23 h。將水解液過0.22 μm的濾膜,取0.5 mL濾液冷凍干燥后,復溶于1 mL體積比為95∶5∶0.2的超純水∶乙腈∶三氟乙酸溶液中。取20 μL用于高效液相色譜測定。

高效液相色譜測定條件:色譜柱:C8(250×4.6 mm,5 μm,Alltech furosine專用);流動相為A:0.4%乙酸的超純水;B:含有0.3% KCl的A,流速:1 mL/min;洗脫條件:98% A+2% B,等梯度洗脫;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm。

1.2.4 游離氨基的測定 參照Jvande等[21]的方法。稱取一定量的反應樣品分散于2.5%的SDS溶液中充分混勻,使其終濃度為5 mg/mL。將混合液在70 ℃的水溶液中水浴20 min,于20 ℃ 14000 r/min離心10 min,取上清液用OPA法測定游離氨基的含量。

1.2.5 褐變強度的測定 采用色差計對不同反應時間的反應樣品褐變強度進行測定。實驗測定了L*值、a*值和b*值。根據(jù)以下公式計算ΔE,將其作為褐變強度。

其中“s”為樣品的值,“0”為反應時間0 h樣品的值。

1.2.6 熒光強度的測定 參照Morale等[22]的方法。稱取30 mg反應樣品,加入3 mL 0.375 mg/mL 鏈霉蛋白酶E(溶于0.1 mol/L pH7.4四硼酸鈉溶液中),40 ℃水浴條件下振蕩36 h。冷卻之后,于4 ℃,4500×g離心10 min,將上清液過0.45 μm濾膜。用于熒光測定。熒光光譜分析參數(shù):激發(fā)波長347 nm,發(fā)射波長415 nm。狹縫寬度Ex/Em=5 nm/nm,響應時間0.5 s,掃描方式為時間掃描20 s。熒光值用AU表示。

1.2.7 蛋白二級結構紅外分析

1.2.7.1 傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR) 取一定量的不同反應時間的反應樣品與溴化鉀共同研磨壓片,用溴化鉀做背景,進行全波段(4000～400 cm-1)掃描,每次信號累加掃描64次,分辨率為4 cm-1。

1.2.7.2 譜圖分析 紅外圖譜分析采用OMNIC 8.0數(shù)據(jù)處理軟件,采用Peakfit 4.12軟件對酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)進行去卷積和曲線擬合,多次擬合使R2大于0.97。根據(jù)李向紅等[23]的研究,確定各子峰和二級結構各成分的關系,計算積分面積,分析糖基化反應后對草魚肌原纖維蛋白二級結構的影響。

1.2.8 乳化性的測定 參考Pearce等[24]的方法略作改動。將反應樣品溶于50 mmol/L PBS(pH7.4),使其終濃度為3 mg/mL。將配制的樣品溶液和純花生油以3∶1的比例在離心管中混合,并以13500 r/min在冰水中均質(zhì)1 min。然后立即從管底取出0.1 mL,并用0.1% SDS稀釋至5 mL,在500 nm處測其吸光值。常溫下靜置10 min后,從管底吸取0.1 mL,用0.1% SDS稀釋至5 mL,在500 nm處測其吸光值。乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)根據(jù)以下公式計算。

其中,A0和A10分別為0 min和10 min時500 nm處測定的吸光值,D為稀釋系數(shù),C為蛋白濃度,φ為油相所占體積分數(shù),L為光路徑寬度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復3次,結果表示為平均值±標準偏差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0,組間差異顯著性分析采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA),p<0.05為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 糠氨酸含量的變化

糠氨酸是由糖基化反應初級階段的特征產(chǎn)物Amadori產(chǎn)物水解產(chǎn)生,其含量可以用來檢測糖基化反應程度。樣品中糠氨酸含量隨反應時間的變化如圖1所示。在反應前12 h,樣品中糠氨酸含量隨著反應時間的延長迅速增加,在48 h達到最高((4.09±0.07) mg/100 mg樣品);隨后呈現(xiàn)出降低的趨勢,到反應結束時,其糠氨酸含量下降到(3.63±0.32) mg/100 mg樣品。因此,糖基化反應過程中,糠氨酸含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,這可能是由于隨著糖基化反應的進行,形成的初級階段產(chǎn)物進一步向中間產(chǎn)物和末期產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,導致糠氨酸含量的降低[25]。Yamaguchi等[25]也發(fā)現(xiàn)在L-賴氨酸與D-葡萄糖體系中,糠氨酸的含量隨反應時間延長呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。

圖1 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物中糠氨酸含量的影響Fig.1 Effect of the heating time on Furosine content in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose注:圖中不同小寫字母之間存在顯著性差異(p<0.05);圖2～圖3,圖6～圖7同。

2.2 游離氨基含量的變化

樣品中游離氨基含量隨反應時間的變化如圖2所示。在反應最初48 h,肌原纖維蛋白的游離氨基含量隨著反應時間延長呈逐漸下降趨勢;反應24 h時,游離氨基含量較反應前下降70.4%(p<0.05);隨后其含量趨于穩(wěn)定;反應結束時,游離氨基含量較反應之前下降79.1%。糖基化反應過程中蛋白或氨基酸中的游離氨基,尤其是賴氨酸和精氨酸中的ε-氨基和α-氨基,與羰基化合物共價結合,體系中游離氨基被消耗,呈現(xiàn)出下降的趨勢[27],隨后游離氨基趨于穩(wěn)定,這可能是因為隨著反應時間的延長,初期產(chǎn)物發(fā)生一定程度的降解[28-29],且加熱造成一些蛋白質(zhì)中游離氨基的暴露[30],與糖基化反應造成的游離氨基的損耗相抵消。此前Pirestani等[26]研究也發(fā)現(xiàn),在90 ℃水溶液反應條件下,油籽分離蛋白和阿拉伯膠在反應15 min內(nèi),游離氨基含量持續(xù)下降,15 min后游離氨基含量趨于穩(wěn)定。

圖2 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物中游離氨基含量的影響Fig.2 Effect of the heating time on Free amino groups content in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.3 褐變強度變化

褐變強度是評價糖基化反應最終階段的指標之一。樣品L*、a*、b*、褐變強度(ΔE)隨反應時間的變化如表1所示。a*正值越大表示樣品顏色越偏紅,負值越小表示樣品顏色越偏綠;b*正值越大表示樣品顏色越偏黃,負值越小表示樣品顏色越偏藍。隨著反應時間的延長,不同反應時間制備的糖基化產(chǎn)物的L*值逐漸減少,這表示亮度隨反應時間的延長逐漸降低。除0 h樣品外,a*值均為正值且依次增大,表示隨著反應時間的延長,糖基化產(chǎn)物顏色都偏紅;b*值都為正,表示顏色都偏黃,且各組之間有顯著性差異(p<0.05),反應96 h后,b*值變?yōu)樵瓉淼?3.8倍。這表明隨著反應時間的延長,糖基化產(chǎn)物的ΔE值逐漸增大,反應結束時ΔE值為反應開始前的37.8倍(p<0.05)。程恒等[34]研究也發(fā)現(xiàn):酪蛋白、β-酪蛋白和乳清蛋白與乳糖糖基化反應過程中,隨著加熱時間的增加,三種乳蛋白-乳糖糖基化產(chǎn)物L*值逐漸減小,a*值和b*值逐漸增大,這與本實驗結果一致。這說明加熱使體系發(fā)生了糖基化反應并生成了有色物質(zhì),并且隨著反應時間的延長,產(chǎn)物顏色逐漸加深。

表1 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物L*、a*、b*、ΔE值(褐變強度)的影響Table 1 Effects of the heating time on values of L*、a*、b*、ΔE in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.4 熒光強度的變化

糖基化反應高級階段產(chǎn)物通常具有熒光特性,通過對樣品中熒光性的檢測可以初步判斷糖基化高級反應的程度[31]。樣品的熒光強度隨反應時間的變化如圖3所示。糖基化產(chǎn)物的熒光強度隨著反應時間的延長先增加后降低的趨勢,且反應最初12 h其熒光強度的增加幅度較小;12 h之后,其熒光強度迅速增加,反應至96 h達到最大值,熒光強度為反應初期的4倍;反應168 h后,熒光強度大幅減少,這可能是因為具有熒光的物質(zhì)發(fā)生一系列反應轉(zhuǎn)化成了無熒光性的色素物質(zhì)[32]。Pirestani等[26]在油菜分離蛋白和阿拉伯膠糖基化反應的研究中也發(fā)現(xiàn),熒光強度隨反應時間的延長逐漸增大,在15 min達到最大,而后持續(xù)降低直至反應結束;Jiang等[33]也發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與核糖在95 ℃濕法反應條件下,熒光強度分別在1 h和2 h達到最大值,隨后迅速降低直至反應結束。

圖3 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物熒光強度的影響Fig.3 Effect of the heating time on fluorescence intensity in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.5 紅外光譜分析

糖基化反應過程中,葡萄糖分子與草魚肌原纖維蛋白共價結合。從FTIR譜圖(圖4)發(fā)現(xiàn),與未反應肌原纖維蛋白相比,反應之后的產(chǎn)物在1080 cm-1附近出現(xiàn)明顯的吸收峰,根據(jù)Geng等[35]的研究,此波段為C-O的伸縮振動,糖基化反應過程中由于共價結合導致體系中羥基和碳氧鍵的增多,使得該波段吸收增強。此外,有文獻報道[36],3300 cm-1附近的峰是N-H伸縮振動特征吸收峰。糖基化反應之后,3300 cm-1附近吸收峰逐漸消失,主要是因為糖基化反應過程中葡萄糖與肌原纖維蛋白的共價結合,導致N-H的減少,使得該波段吸收減少,也進一步表明草魚肌原纖維蛋白與葡萄糖共價結合形成了共聚物。

圖4 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物FTIR的影響Fig.4 Effect of the heating time on the FTIR spectra in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

不同反應時間的樣品的二級結構如圖5所示。糖基化修飾對草魚肌原纖維蛋白的二級結構影響很小,α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角基本無變化,無規(guī)則卷曲整體呈增大趨勢,但變化不明顯。反應0 h時,無規(guī)則卷曲百分含量為17.05%,而在反應48 h達到最大18.21%,之后又降低至17.82%;β-折疊百分含量0 h樣品時為33.42%,反應96 h后達到最低,下降至30.89%。此結論也與前人研究結果相一致:Sun等[37]研究雞卵清蛋白(OVA)與葡萄糖、乳糖和阿洛酮糖糖基化反應過程中發(fā)現(xiàn),OVA經(jīng)糖基化反應后,α-螺旋略微減少,β-折疊稍有增加,糖基化反應對OVA二級結構的影響較小;同樣地,Enomoto等[38]也發(fā)現(xiàn)干法反應條件下,β-乳球蛋白與麥芽五糖糖基化反應后并未對β-乳球蛋白的二級結構造成顯著性變化。

圖5 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物二級結構的影響Fig.5 Effects of the heating time on the secondary structure in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性是衡量蛋白質(zhì)促進油-水型乳狀液形成能力的指標,乳化穩(wěn)定性是指維持乳狀液穩(wěn)定存在的能力。如圖6所示,反應樣品的乳化性隨時間的延長呈先增加后降低的趨勢。反應6 h時,其乳化性未呈現(xiàn)顯著性變化(p>0.05);6 h之后迅速增加,在48 h達到最大(0.097 m2/g),為反應初期的1.32倍;48 h之后乳化性逐漸降低,反應168 h后,乳化性值為0.079 m2/g。如圖7所示,隨著反應時間的延長,反應樣品的乳化穩(wěn)定性在6 h之前沒有顯著性增加,6 h之后迅速增加,在48 h也達到最大,從反應初期的14.43 min增加到22.06 min(p<0.05),之后逐漸降低。閆冰等[39]研究葡聚糖與ε-聚賴氨酸共價復合物發(fā)現(xiàn),乳化穩(wěn)定性隨著反應時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在反應時間為18 h時,乳化穩(wěn)定性達到最大值,這與本文的研究結果相一致。

圖6 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物乳化性的影響Fig.6 Effect of the heating time on the emulsifying activity in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

圖7 加熱時間對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of the heating time on the emulsifying stability in grass carp myofibrillar proteinglycated with glucose

草魚肌原纖維蛋白與葡萄糖糖基化反應過程中,在反應開始時,少量糖的接入使得糖基化反應產(chǎn)物具有兩親性,表面活性增大,從而使其乳化能力提高[40];然而,隨著反應時間的延長,蛋白質(zhì)發(fā)生變性以及溶解度的降低,導致其乳化能力的降低[12]。

研究發(fā)現(xiàn),在50 ℃,44% RH條件下,反應48 h時(初級階段產(chǎn)物Amadori產(chǎn)物含量最高),肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著提高,分別為反應初期的1.32倍(p<0.05)和1.53倍(p<0.05);反應48 h之后,乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著降低(p<0.05)。由此,可以推斷糖基化早期階段可以改善魚肉肌原纖維蛋白的乳化性能,隨著糖基化反應程度的加深會造成乳化性能的降低。因此,通過控制一定的反應條件,可將反應控制在初級階段,這對改善魚肉肌原纖維蛋白的功能特性非常重要。

2.7 相關性分析

糖基化反應產(chǎn)物的乳化性能與其化學特性指標的相關性如表2所示。乳化性與糠氨酸含量極顯著的正相關(r=0.74,p<0.01),與游離氨基含量呈極顯著的負相關(r=-0.54,p<0.01),但與色差ΔE和熒光強度無相關性;乳化穩(wěn)定性與糠氨酸含量、熒光強度呈極顯著的正相關(r=0.94,p<0.01;r=0.78,p<0.01),與色差ΔE呈顯著的正相關(r=0.51,p<0.05),與游離氨基含量呈極顯著的負相關(r=-0.93,p<0.01)。研究結果表明:草魚肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性受糖基化反應程度的影響。這為提高魚肉肌原纖維蛋白乳化性能提供了參考。

表2 不同加熱時間制備的草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物的化學特性指標與乳化性能的相關性分析Table 2 Correlation analysis of the chemical characterization grass carp myofibrillar protein-glucose MRPs and the emulsifying property

3 結論

通過對草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物糠氨酸、熒光強度、游離氨基含量以及色差的測定分析發(fā)現(xiàn),隨著加熱時間的延長,糠氨酸含量與熒光強度均呈先增大后減小的變化趨勢,分別在反應48 h((4.09±0.07) mg/100 mg樣品)和反應96 h((4764.33±92.42) AU)達到最大值;游離氨基的含量逐漸降低,在48 h趨于穩(wěn)定;總色差ΔE值則逐漸增大。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn),糖基化復合物二級結構沒有發(fā)生明顯的變化。與反應初期相比,該復合物乳化性和乳化穩(wěn)定性也呈先增大后降低的趨勢,均在48 h時達到最高值。進一步通過相關性分析發(fā)現(xiàn),草魚肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性受糖基化反應程度的影響。因此,通過對糖基化反應的控制,實現(xiàn)了具有較高乳化性能的糖基化草魚肌原纖維蛋白的制備,這為草魚蛋白在食品工業(yè)化中的應用提供理論基礎。