李天宇,劉占燕,紀(jì)欣彤,李 瑞

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院,山東日照 276800)

在生物技術(shù)下游過程中,蛋白質(zhì)的分離面臨兩個巨大的挑戰(zhàn):一,蛋白質(zhì)在動植物細(xì)胞培養(yǎng)液或微生物發(fā)酵液中濃度低[1-3];二,蛋白質(zhì)對高溫、極端pH、極端離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑的耐受性低,容易喪失功能活性[4-6]。在工業(yè)上,蛋白質(zhì)的分離主要依靠沉淀[7]、色譜分離[8]和膜分離[9]等技術(shù),但是它們分離低濃度蛋白質(zhì)的效率低且成本高,制成的蛋白質(zhì),特別是藥物蛋白價格較高。因此,有必要開發(fā)新型的分離技術(shù)以降低蛋白質(zhì)的分離成本。泡沫分離是一項基于界面吸附原理,以上升泡沫為分離介質(zhì)的分離技術(shù)[10]。該技術(shù)具有低濃度下效率高、設(shè)備和工藝簡單、投資少、能耗低和不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn),在大幅降低蛋白質(zhì)分離成本方面有巨大的潛力[11-13]。

在泡沫分離過程中,大量氣-液界面的產(chǎn)生很容易造成蛋白質(zhì)的變性,最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性收率的降低[14-16]。這極大的限制了泡沫分離技術(shù)在藥物蛋白及酶等功能蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域的應(yīng)用。因此有必要對泡沫分離過程中氣-液界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的機(jī)理進(jìn)行研究從而進(jìn)行有效的抑制,以提高功能性蛋白質(zhì)的分離效果。本文在綜述了泡沫分離過程中界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上,對其抑制方法進(jìn)行了對比和總結(jié),并提出了提高功能性蛋白質(zhì)泡沫分離效果所需進(jìn)一步研究的問題。

1 泡沫分離過程中的蛋白質(zhì)變性

蛋白質(zhì)分子同時具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán),是一種生物表面活性物質(zhì)[17]。因此,它可以吸附在氣-液界面上從而穩(wěn)定氣泡[18],這是泡沫分離蛋白質(zhì)的可行性基礎(chǔ)。氣-液界面屬于一種疏水性界面,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子吸附在該界面時,該界面會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性[19-20]。因為氣-液界面是蛋白質(zhì)泡沫分離的介質(zhì),所以在該分離過程中蛋白質(zhì)變性是一種常見現(xiàn)象。表1總結(jié)了泡沫分離過程中易變性的蛋白質(zhì)及其相應(yīng)的最大變性率。由于蛋白質(zhì)的變性,泡沫分離的效果明顯降低[14-15],因此有必要對泡沫分離過程中的變性機(jī)理進(jìn)行研究從而采取有效的措施進(jìn)行抑制。

表1 泡沫分離過程中易變性的蛋白質(zhì)及最大變性率Table 1 Denatured proteins and their maximaldenaturation ratio in foam fractionation

2 泡沫分離過程中蛋白質(zhì)的變性機(jī)理

2.1 泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的分子機(jī)理

蛋白質(zhì)分子是具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的生物大分子,研究泡沫分離過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)所發(fā)生的變化,是有效抑制其變性所需解決的關(guān)鍵問題之一。在泡沫分離塔中,氣泡處于不斷上升的狀態(tài),由于缺乏在線檢測上升氣泡表面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的方法,所以在以往的報道中,研究者們只能通過對比起泡前后溶液中蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)來研究分離過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了何種變化,所采用的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)檢測方法一般為圓二色譜法和熒光光譜法[29-33]。由表2可知,泡沫對不同蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的影響是不同的,一般來說,泡沫不會導(dǎo)致剛性蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,但是會導(dǎo)致所有蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[31-32]。因為很多蛋白質(zhì)的功能活性主要決定于其三級結(jié)構(gòu),所以泡沫很容易誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的失活[34]。

表2 泡沫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化分析方法及主要研究結(jié)果Table 2 Analytical methods and main results of foam-induced structural changes of proteins

盡管上述研究方法能證實泡沫分離前后的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化,但是由于上升氣泡表面(即氣-液界面)上的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)無法檢測,所以無法闡明這種變化是如何發(fā)生的。因此,檢測氣-液界面上的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)成為闡明泡沫分離過程中界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性分子機(jī)理的關(guān)鍵。隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步,表面擴(kuò)張流變法[35]、紅外反射吸收光譜法[36]、紫外-可見反射吸收光譜法[37]和頻振動光譜法[38]等檢測方法的出現(xiàn)為解析氣-液界面上(即靜態(tài)水表面)的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)提供了技術(shù)支持。陳戰(zhàn)教授[39]指出和頻振動光譜可用于生物大分子界面結(jié)構(gòu)的分析。Engelhardt等人[40]利用和頻振動光譜研究了β乳球蛋白分子在氣-液界面上(即靜態(tài)水表面)的基團(tuán)取向,解釋了β乳球蛋白分子的穩(wěn)泡機(jī)理。雖然這些方法能很好地解析氣-液界面上的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu),但是近年來,只有Barackov等[36]將其用于泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的分子機(jī)理研究。Barackov等[36]利用紅外反射吸收光譜分析了β-酪蛋白和溶菌酶在靜態(tài)水表面上的二級結(jié)構(gòu),并結(jié)合泡沫分離前后蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化解析了泡沫分離過程中這兩種蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的歷程。研究表明,當(dāng)溶菌酶吸附在氣-液界面上時,其分子結(jié)構(gòu)會展開,但是當(dāng)從氣-液界面解吸后展開的分子結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)到初始的狀態(tài),發(fā)生了不可逆的結(jié)構(gòu)變化,因而失去了活性。但是β-酪蛋白在吸附和解吸過程中其二級結(jié)構(gòu)均未發(fā)生明顯地變化,因此,泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的主要原因是氣-液界面誘導(dǎo)的不可逆的分子結(jié)構(gòu)變化。

根據(jù)上述研究結(jié)果,繪制了泡沫分離過程中界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的基本原理示意圖,如圖1所示。在起泡過程中,蛋白質(zhì)分子吸附在氣-液界面上,分子空間結(jié)構(gòu)展開,其內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于氣相,使蛋白質(zhì)分子能夠穩(wěn)定地吸附在界面上[35,37]。在消泡過程中,吸附的蛋白質(zhì)分子要從氣-液界面上解吸下來,但是在該過程中卻無法恢復(fù)到天然的分子構(gòu)象進(jìn)而失去活性。蛋白質(zhì)在氣-液界面上的吸附是其成功泡沫分離的關(guān)鍵,因而氣-液界面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化是不可避免的。盡管前人的研究已揭示了泡沫分離過程中界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的基本原理,但是關(guān)于氣-液界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的基礎(chǔ)研究還相對較少,所以真正從分子水平上闡明這一問題還需要廣大研究者們的長期努力。

圖1 泡沫分離過程中界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性基本原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of interface-inducedprotein denaturation in foam fractionation

2.2 泡沫演化在界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性中的作用機(jī)理

在泡沫分離塔內(nèi),隨著泡沫的上升,泡沫的形態(tài)不斷演化,主要表現(xiàn)為以下兩個方面:一,由于重力泡沫中的液體逐漸排出泡沫回流到主體液相中,泡沫中的持液量逐漸減少,泡沫逐漸變干;二,泡沫內(nèi)相鄰氣泡間的液膜逐漸變薄,氣泡間氣體擴(kuò)散和氣泡聚并加劇,氣泡逐漸變大,氣-液界面總面積逐漸減少[41-43]。隨著泡沫的不斷演化,泡沫中的蛋白質(zhì)的濃度逐漸升高,與此同時吸附在氣-液界面上蛋白質(zhì)的量逐漸降低[44]。在氣-液界面誘導(dǎo)人體免疫球蛋白G1聚集的研究中,Bee等[45]發(fā)現(xiàn)人體免疫球蛋白G1聚集體的產(chǎn)生量與氣-液界面積的變化呈線性相關(guān)。Wiesbauer等[46]在研究氣-液界面積誘導(dǎo)人體生長激素聚集的過程中也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律。因此,氣-液界面積變化對界面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性有重要的影響。在上述研究的基礎(chǔ)上,Li等[44,47]以牛血清白蛋白(BSA)為目標(biāo)蛋白,研究了泡沫演化對BSA聚集的影響,結(jié)果表明,隨著泡沫的演化,泡沫內(nèi)的氣-液界面積不斷減少,吸附的BSA不斷從氣-液界面上解吸下來且濃度增加,所以容易彼此間相互聚集,最終導(dǎo)致BSA的聚集率逐漸增加,其原理示意圖如圖2所示;此外,BSA聚集率隨氣-液界面積減少量的變化與泡沫排液緊密相關(guān):當(dāng)泡沫含水量較高時,BSA聚集率隨氣-液界面積減少量的增加緩慢增加;當(dāng)泡沫含水量較低時,BSA的聚集率隨著氣-液界面積的減少量的增加快速線性增加,泡沫演化程度的加劇會明顯增加消泡液內(nèi)BSA聚集體的相對含量,嚴(yán)重降低了BSA單體的回收率和濃縮比。由于強(qiáng)化泡沫排液(即加劇泡沫演化)是提高蛋白質(zhì)富集比的主要方法[48],所以如何解決蛋白質(zhì)富集比提高與蛋白質(zhì)變性加劇之間的矛盾,對于有效提高泡沫分離效果至關(guān)重要。綜上所述,研究泡沫演化對泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性影響的作用機(jī)理對于有效提高蛋白質(zhì)的泡沫分離效果有重要的意義。但是,目前的研究體系僅限于為數(shù)不多的有聚集現(xiàn)象的蛋白質(zhì),缺少泡沫演化對無聚集現(xiàn)象蛋白質(zhì)泡沫分離過程中變性影響的研究,因而尚難形成基本的規(guī)律。

圖2 泡沫演化加劇氣-液界面誘導(dǎo)牛血清白蛋白(BSA)聚集原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of foam evolution enhancingaggregation of bovine serum albumin(BSA)

3 泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的抑制

作為一項蛋白質(zhì)分離技術(shù),泡沫分離的目的就是為了實現(xiàn)蛋白質(zhì)的富集和回收。因此,抑制泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的方法必須同時滿足以下兩個條件才能得以使用:一,不能明顯降低泡沫分離的效果;二,能有效抑制蛋白質(zhì)的變性。目前,泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的機(jī)理尚未被清楚闡明,不能為抑制變性提供充分的理論支撐。但是,一些研究者已經(jīng)在抑制泡沫分離中蛋白質(zhì)活性損失方面做出了努力,下面將對這些工作進(jìn)行分析總結(jié)。

3.1 泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的提前抑制

溶液的理化條件是影響蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的重要因素,而蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)是影響泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性因素的關(guān)鍵因素[33,49]。因此,一些研究者通過提前改變進(jìn)料液的理化條件來減少泡沫分離過程中的蛋白質(zhì)變性,以提高泡沫分離效果。Li等[49]研究發(fā)現(xiàn)隨著pH由3.0逐漸增加到7.0,BSA的分子結(jié)構(gòu)逐漸收縮,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加,使得泡沫分離過程中BSA的聚集率逐漸降低。Liu等[14]和Loha等[22]也通過改變進(jìn)料液的pH降低了蛋白質(zhì)變性率,提高了泡沫分離效果。此外,Zhang等[50]通過向體系中添加不容的無機(jī)鹽改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度,提高乳鏈菌肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,提高了泡沫分離過程中乳鏈菌肽的活性回收率。

除了改變?nèi)芤旱膒H和離子強(qiáng)度等參數(shù)外,提前向進(jìn)料液中添加蛋白質(zhì)保護(hù)劑也能有效抑制泡沫分離過程中的蛋白質(zhì)變性。Wang等[15]通過添加海藻糖來降低泡沫分離過程中乳鏈菌肽的活性損失,結(jié)果顯示當(dāng)海藻糖濃度為1 g/L時,乳鏈菌肽的活性損失由27.5%降低到了5.9%。研究者只是認(rèn)為海藻糖是一個有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑,對于海藻糖抑制泡沫分離過程中乳鏈菌肽失活的機(jī)理并未闡明。Li 等[51]發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精能與BSA分子中的芳香族氨基酸發(fā)生相互作用,并且能輔助變性的蛋白質(zhì)復(fù)性[52],所以通過提前向進(jìn)料液中添加β-環(huán)糊精有效降低了泡沫分離過程中的BSA聚集。此外,他們還利用β-環(huán)糊精減少了泡沫分離過程中菠蘿蛋白酶的變性,使其活性收率和比酶活分別提高了34.1%和110.7%[53]。但是β-環(huán)糊精能降低蛋白質(zhì)分子在氣-液界面上的吸附,所以添加β-環(huán)糊精不利于蛋白質(zhì)質(zhì)量收率的提高[51,53]。

3.2 泡沫分離后變性蛋白質(zhì)的復(fù)性

對于泡沫分離來說,消泡是不可缺少的單元操作[54]。在消泡過程中,吸附的蛋白質(zhì)從氣-液界面上解吸下來溶解到消泡液中。由圖2可知,解吸的蛋白質(zhì)分子由于無法恢復(fù)到天然的分子構(gòu)象而失去活性。由于改變?nèi)芤旱睦砘瘲l件有可能以犧牲蛋白質(zhì)的質(zhì)量收率來提高其活性收率[51,53],所以一些研究者在不降低蛋白質(zhì)質(zhì)量收率的前提下,在消泡過程中通過復(fù)性解吸的蛋白質(zhì)來提高其活性收率。Burapatana等[55]通過向消泡液中添加β-環(huán)糊精來降低泡沫分離過程中纖維素酶的活性損失,結(jié)果表明β-環(huán)糊精可以使消泡液中纖維素酶的酶活提高3倍多,這是因為β-環(huán)糊精作為人工分子伴侶可以輔助變性的蛋白質(zhì)復(fù)性[56]。Li等[57]利用含吐溫20的消泡劑在消泡的同時有效抑制了泡沫誘導(dǎo)的大豆乳清蛋白的聚集,使得消泡液中的蛋白質(zhì)沉淀減少了80%。由此可見,通過復(fù)性泡沫分離后變性的蛋白質(zhì)從而提高活性收率的方法是可行的。并且相對于改變?nèi)芤旱睦砘瘲l件來說,該方法更有利于泡沫分離效果的提高,但是相關(guān)報道卻寥寥無幾。

4 結(jié)論與展望

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,大量的重組和非重組蛋白質(zhì)相繼實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。目前,發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白濃度普遍偏低,這就為具有低濃度下效率高和成本低等優(yōu)點(diǎn)的泡沫分離技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供了機(jī)會。但是,泡沫分離技術(shù)僅在分離發(fā)酵液中乳鏈菌肽的過程中實現(xiàn)了工業(yè)化應(yīng)用,在蛋白質(zhì)分離方面的工業(yè)化應(yīng)用還未見報道。究其原因,主要是因為泡沫分離蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)理論研究,特別是分子水平的研究,還十分薄弱。

氣-液界面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化是泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性的根本原因。但是,大量的氣-液界面又是蛋白質(zhì)泡沫分離的唯一介質(zhì),為了解決這個矛盾從而促進(jìn)泡沫分離蛋白質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn),未來的研究可以從以下三個方面進(jìn)行:一、加強(qiáng)泡沫分離蛋白質(zhì)過程的分子水平研究,借助分子模擬技術(shù)研究氣-液界面吸附和解吸過程中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變化及傳質(zhì)規(guī)律,更為深入得闡明氣-液界面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性機(jī)理;二、開展氣-液界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性動力學(xué)的研究,確定泡沫分離過程中導(dǎo)致蛋白質(zhì)最大變性速率的關(guān)鍵階段,闡明氣-液界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的宏觀規(guī)律;三、開展泡沫分離過程中蛋白質(zhì)變性抑制機(jī)理的研究,闡明氣-液界面解吸過程中蛋白質(zhì)分子與變性抑制劑的相互作用機(jī)理及其復(fù)性動力學(xué),為氣-液界面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的有效抑制提供理論依據(jù)。