余慧冬，秦亞東*，周娟娟

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽 蕪湖 241002)

牡丹皮為毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr．)的干燥根皮，苦、辛，微寒。歸心、肝、腎經(jīng)，具清熱涼血，活血化瘀之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究證實牡丹皮在抗腫瘤、抗菌、抗心律失常、抗動脈粥樣硬化及增強(qiáng)免疫力等方面具有確切的作用[2-3]，其主要有效成分丹皮酚是研究的熱點化合物[4-5]。

牡丹皮作為常用大宗藥材，具有極高的藥用價值和悠久的用藥歷史。安徽是牡丹皮的主產(chǎn)區(qū)之一，尤其是安徽銅陵產(chǎn)的牡丹皮具有較高盛譽(yù)，稱為“鳳丹”，為安徽著名道地藥材[6]。近些年來，隨著牡丹皮臨床使用量的增加，野生牡丹日益減少，現(xiàn)皖南許多地區(qū)大面積栽培牡丹。由于中藥材質(zhì)量受地理環(huán)境狀況的影響，因而不同產(chǎn)地牡丹皮質(zhì)量可能存在質(zhì)量差異。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對安徽蕪湖產(chǎn)地牡丹皮質(zhì)量研究報道較少，為牡丹皮藥材資源合理應(yīng)用及客觀評價，根據(jù)2015版《中國藥典》第一部[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，對牡丹皮中的主要有效成分丹皮酚進(jìn)行含量測定，以期對安徽蕪湖產(chǎn)地牡丹皮的質(zhì)量控制、合理利用牡丹皮藥材資源提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Agilent Technologies 1100(美國安捷倫公司，二元泵，自動進(jìn)樣器，DAD二極管陣列檢測器)；色譜柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm，5μm)；DV215CD型 Discovery電子天平(美國OHAUS公司)；U-16K型臺式離心機(jī)(德國SIGMA公司)；KQ-250B型超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司)。

丹皮酚對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號: 110708-201506，純度99.20%，峰面積歸一化法)。甲醇(色譜純，美國TEDIA，15075021)；乙腈(色譜純，美國TEDIA，15055017)；水(娃哈哈純凈水，杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司)；磷酸(色譜純，上海展云化工有限公司)。牡丹皮采集于安徽蕪湖南陵縣、丫山、弋江區(qū)等地，共9個批次，經(jīng)安徽中藥資源研究汪榮斌副教授鑒定為毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr．)的干燥根皮，樣品信息見表1。

表1 牡丹皮樣品信息

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流動相為溶劑A：0.1%磷酸乙腈，溶劑B：0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：梯度洗脫，0→10min，溶劑A由10%→25%，10→25min，溶劑A由25%→38%；；流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長274nm，進(jìn)樣量10μL。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 對照品溶液的制備：精密稱取丹皮酚對照品5.2mg,用甲醇定容于10mL棕色容量瓶中, 搖勻，配制成濃度為0.52mg/mL的丹皮酚對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備：取經(jīng)干燥至恒重的牡丹皮藥材粉末(過四號篩)約0.5g，精密稱定后置于具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，精密稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，靜置，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足損失重量，離心處理(5000r/min，10min)，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

按“1.2.1”色譜條件及“1.2.2”溶液制備條件，分別對丹皮酚對照品溶液、供試品溶液進(jìn)行進(jìn)樣，記錄色譜圖[3,7]。從圖2中可見，丹皮酚在25min以內(nèi)完成分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000。對照品及供試品溶液代表性色譜圖見圖1、圖2所示。

圖1 丹皮酚對照品在274nm下HPLC圖(1：丹皮酚)

圖2 牡丹皮樣品在274nm下HPLC圖(1：丹皮酚)

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“1.2.2.1”項下制備的對照品適量，以甲醇為溶劑進(jìn)行梯度稀釋2、4、8、16、32倍，搖勻，過0.22μm微孔濾膜過濾后按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖及丹皮酚色譜峰峰面積。以峰面積值 (Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度 (X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸曲線見圖3，回歸方程Y=3870.52X+17.5，線性系數(shù)R=0.9996，丹皮酚在0.0325～0.52μg之間線性關(guān)系良好。

圖3 丹皮酚對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗

取“1.2.2.1”項下制備的對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次, 記錄丹皮酚色譜峰峰面積， RSD為0.57%。結(jié)果表明儀器精密度符合要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取“1.2.2.2”項下制備的供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件，分別于0、3、6、9、12 h 進(jìn)樣,記錄丹皮酚色譜峰峰面積，RSD為0.64%。結(jié)果表明丹皮酚供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗

取牡丹皮藥材粉末約0.5g,共6份， 按“1.2.2.2”項下方法進(jìn)行樣品處理, 按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，記錄丹皮酚色譜峰峰面積，RSD為1.62%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗

精密稱取牡丹皮粉末5份[3,7],每份約0.5g，按“1.2.2.2”供試品溶液制備項下方法進(jìn)行制備，然后加入“1.2.2.1”項下制備的丹皮酚對照品溶液適量，置50mL棕色具塞錐形瓶中 ,加甲醇45 mL，超聲處理30min,靜置，放冷后以甲醇定容至刻度，搖勻,過0.22μm濾膜，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，并計算含量,結(jié)果丹皮酚平均回收率為102.51%，RSD為1.26%，結(jié)果表明對照品回收率良好。

2.7 樣品含量測定

按照上述HPLC法測定方法測定安徽蕪湖不同產(chǎn)地牡丹皮樣品[3,7]，結(jié)果見表2。

表2 牡丹皮中有效成分丹皮酚含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇：參考2015版《中國藥典》(一部)及文獻(xiàn)報道，分別嘗試對水、甲醇、乙醇、50%甲醇、50乙醇為溶劑，以丹皮酚含量為指標(biāo)，經(jīng)過試驗，以甲醇為溶劑對牡丹皮中的主要有效成分丹皮酚進(jìn)行提取，含量最高，故選擇以甲醇為溶劑。

3.2 提取方式的選擇：分別采用超聲提取法、回流提取法、滲漉法、浸漬法進(jìn)行對比研究，以丹皮酚含量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)常規(guī)提取方式對丹皮酚含量并無顯著影響，考慮到提取的便捷性及降低能源損耗，選用了超聲提取方式。

3.3 本次試驗對安徽蕪湖不同產(chǎn)地野生牡丹皮中的主要有效成分丹皮酚的含量進(jìn)行測定，且丹皮酚也是2015版《中國藥典》(一部)所要求進(jìn)行含量測定的成分。從測定結(jié)果看，安徽蕪湖不同產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚的含量均大于《中國藥典》的規(guī)定含量(不少于1.2%)，且丹皮酚的含量存在一定的差異，這可能與不同自然環(huán)境及生態(tài)環(huán)境等因素存在一定的關(guān)系。從丹皮酚含量分析，安徽蕪湖地區(qū)適合牡丹皮藥材的栽培。