成 昭，周 磊,苗延青,梁 飛

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院/藥物化學(xué)研究所,陜西 西安 710021)

藥物分子標(biāo)記與示蹤可實(shí)現(xiàn)藥物代謝的可視化,對(duì)于藥物濃度和藥代動(dòng)力學(xué)研究、藥效評(píng)價(jià)具有重要意義。傳統(tǒng)的同位素標(biāo)記法需借助于放射顯影技術(shù)實(shí)現(xiàn)藥物分布部位(定性)和分布量(定量)實(shí)時(shí)研究,或借助采集血樣、尿樣等代謝樣本,再進(jìn)一步聯(lián)用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析,因而活體應(yīng)用受限,更適用于血藥濃度動(dòng)力學(xué)、組織分布及排泄物分析等。借助光學(xué)定性與定量分析手段示蹤藥物分子、研究其分布與代謝,能夠有效避免活體損傷、簡(jiǎn)化分析手段。將熒光衍生技術(shù)應(yīng)用于藥物分子的熒光標(biāo)記、借助熒光成像即時(shí)示蹤藥物分子,直觀可視地監(jiān)測(cè)其分布、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用的變化,可揭示藥物作用路徑、進(jìn)行藥理學(xué)分析,進(jìn)一步評(píng)價(jià)藥效,對(duì)研究藥物作用的信號(hào)通路、進(jìn)行疾病治療具有重要意義。

本論文設(shè)計(jì)了以熒光衍生試劑特異性標(biāo)記藥物分子的某些原子或基團(tuán),以共價(jià)結(jié)合、弱作用力吸附等方法實(shí)現(xiàn)待分析物的可視化標(biāo)記[1-2]。選擇蛋白質(zhì)N-端標(biāo)記試劑丹磺酰氯(N,N-二甲氨基-5-萘磺酰氯,Dimethylamino Naphthalene Sulfonyl Chloride,DNS-Cl),經(jīng)過以簡(jiǎn)單含氮物建立反應(yīng)條件、復(fù)雜含氮物確立衍生條件、實(shí)現(xiàn)藥物分子中非活性氨基標(biāo)記的遞進(jìn)式實(shí)驗(yàn)方案,檢出DNS-Cl特征熒光信號(hào),進(jìn)行藥物分子的定性及定量考查;并進(jìn)一步借助熒光成像技術(shù)示蹤藥物分子[3-4],為藥物作用路徑研究提供了一種直觀可視的方法。分析藥物代謝周期內(nèi)標(biāo)記物的光穩(wěn)定性,并對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行光學(xué)性質(zhì)分析與體外活細(xì)胞評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),探究標(biāo)記物在體外活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的作用效果。實(shí)驗(yàn)方案具有操作簡(jiǎn)便、取樣量少、標(biāo)記穩(wěn)定性高等優(yōu)勢(shì),且能夠?qū)Ψ治鑫镞M(jìn)行多參數(shù)考查,如熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、標(biāo)記光穩(wěn)性能等,可應(yīng)用于多種生物樣品[5-9]和環(huán)境樣品的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)(UV-2102 PCS,廣州滬瑞明儀器有限公司),熒光分光光度計(jì)(LS55,鉑金埃爾默股份有限公司),倒置熒光顯微鏡(U-LH 100 hG IX73,成貫儀器有限公司),多功能酶聯(lián)檢測(cè)儀(1510 Mwltiskan Go,賽默飛世爾科技有限公司)。

丹磺酰氯(HPLC,阿拉丁試劑公司),鄰苯二胺(AR,阿拉丁試劑公司),對(duì)苯二胺(AR,阿拉丁),鄰氨基苯酚(AR,阿拉丁試劑公司),N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(AR,阿拉丁試劑公司),阿莫西林膠囊(0.25 g,哈藥集團(tuán)制藥總廠),硝苯地平緩釋片(I)(10 mg,揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司),葉酸(400 μg,美國(guó)健安喜營(yíng)養(yǎng)食品公司),克拉霉素分散片(0.25 g,廣東怡康制藥有限公司),奧美拉唑腸溶膠囊(20 mg,沈陽圣元藥業(yè)有限公司)。

1.2 熒光衍生標(biāo)記

DNS-Cl的衍生標(biāo)記反應(yīng)需在堿性條件下進(jìn)行[10-11],本文將 DNS-Cl分別應(yīng)用于硝苯地平、阿莫西林、葉酸、克拉霉素、奧美拉唑等含氮藥物中非剛性氮原子的熒光標(biāo)記(圖1)。

1.2.1 簡(jiǎn)單含氮物 將1.0 mg DNS-Cl，3.4 mg鄰苯二胺，25.0 mg碳酸鉀及2.5 mL乙酸乙酯加入50 mL圓底燒瓶中,進(jìn)行衍生標(biāo)記,薄層板監(jiān)測(cè)反應(yīng)。分別考查了60℃及80℃的反應(yīng)溫度,確定衍生反應(yīng)時(shí)間為20 min、反應(yīng)溫度為80℃。并進(jìn)行80℃下的重復(fù)實(shí)驗(yàn),反應(yīng)重現(xiàn)性良好。

上述條件也適用于簡(jiǎn)單含氮物對(duì)苯二胺及鄰氨基苯酚的熒光衍生反應(yīng)。

1.2.2 復(fù)雜含氮物 將1.0 mg DNS-Cl，3.4 mg N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽，25.0 mg碳酸鉀，2.5 mL乙酸乙酯加入50 mL圓底燒瓶中,80℃下回流反應(yīng)35 min,薄層板監(jiān)測(cè)。

1.2.3 含氮藥物 實(shí)驗(yàn)中所用含氮藥物均為藥店購(gòu)入藥品,應(yīng)去除輔料干擾。藥物輔料一般使用淀粉、糖粉等作為稀釋劑或崩解劑,或可溶性枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)輔料,利用其不溶于有機(jī)溶劑的特性,根據(jù)平均片重及每片有效含量計(jì)算藥物分子含量、進(jìn)行藥物片劑或膠囊內(nèi)劑的準(zhǔn)確稱重,使用有機(jī)溶劑進(jìn)行充分溶解,再離心取上清液,即可去除干擾。

準(zhǔn)確稱取5.8mg阿莫西林,于離心管中加3 mL甲醇振蕩溶解,6 000 r/min離心5 min取上清液,去除輔料干擾;將1.0 mg DNS-Cl，阿莫西林甲醇提取液，50.0 mg碳酸鉀及5 mL乙酸乙酯加入50 mL圓底燒瓶中,80℃油浴加熱回流2 h,薄層板監(jiān)測(cè)反應(yīng)。

同理,阿莫西林、葉酸、克拉霉素、奧美拉唑等含氮藥物進(jìn)行熒光衍生反應(yīng)的試劑用量分別為143.9 mg硝苯地平，3.5 mL甲醇，4.0 mg DNS-Cl，100 mg碳酸鉀及10 mL乙酸乙酯(80℃回流2 h);1.1 g葉酸，15 mL甲醇，1.0 mg DNS-Cl，25.0 g碳酸鉀及2.5 mL乙酸乙酯(80℃回流1.1 h);34.6 mg克拉霉素，3 mL甲醇，2.0 mg DNS-Cl，25.0 mg碳酸鉀及5 mL乙酸乙酯(80℃回流2.5 h);67.1 mg奧美拉唑，3.0 mL甲醇，1.0 mg DNS-Cl，25.0 mg碳酸鉀，5 mL乙酸乙酯(80℃回流1.6 h)。

圖1 熒光衍生路線Fig.1 Fluorescence derivatization route

1.3 熒光衍生標(biāo)記穩(wěn)定性分析

保持DNS-Cl-阿莫西林衍生物反應(yīng)液恒溫37℃下,分別在0，2，20，24，31，44，48，52 h取樣,蒸餾水定容，得到濃度為1×10-4mol/L的溶液,分析DNS-Cl熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)462 nm處熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的穩(wěn)定性。評(píng)價(jià)阿莫西林體內(nèi)半衰期及藥物完全代謝排出體外之前,DNS-Cl能否有效標(biāo)記藥物分子,實(shí)現(xiàn)藥物代謝周期內(nèi)直觀可視的代謝路徑示蹤。

另對(duì)DNS-Cl-硝苯地平(0，3，5，17，25，42，48，49，77 h)，DNS-Cl-葉酸(0，3，6，18，21，24，28，51，67 h)，DNS-Cl-克拉霉素(0，3，7，21，46，49，52，55，69 h)及DNS-Cl-奧美拉唑(0，7，21，25，29，45，57，69 h)等熒光衍生產(chǎn)物進(jìn)行了相似間隔取樣分析。

1.4 細(xì)胞評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 采用MTT法[8]對(duì)DNS-Cl-硝苯地平、DNS-Cl-克拉霉素衍生產(chǎn)物進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受試細(xì)胞(ECV304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株)制備細(xì)胞懸液,密度約為5×104個(gè)/mL,加入96孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)8 000～10 000個(gè)。待細(xì)胞貼壁后,各樣品按起始濃度倍數(shù)稀釋加入各自組中,每組為2個(gè)平行孔,設(shè)定體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO為溶劑對(duì)照。加藥后置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h。測(cè)定前，徹底棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值,利用下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,抑制率%=[(1-OD藥液/OD對(duì)照)×100%][9]。

1.4.2 細(xì)胞熒光標(biāo)記 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受試細(xì)胞(ECV304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株)制備細(xì)胞懸液,密度約為5×104個(gè)/mL,加入6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)8 000～10 000個(gè),待細(xì)胞貼壁后,各樣品按起始濃度倍數(shù)稀釋(5 000，10 000，20 000 μmol/L)加入各孔中,加藥后置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后用PBS buffer清洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察,可看到藍(lán)色熒光發(fā)射通道內(nèi)細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)。在明場(chǎng)中拍攝聚集生長(zhǎng)且形態(tài)完整良好的細(xì)胞,并在暗場(chǎng)中拍攝熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光衍生標(biāo)記及穩(wěn)定性分析

配制濃度為1×10-5mol/L 的DNS-Cl-鄰苯二胺衍生產(chǎn)物水溶液,以314 nm波長(zhǎng)激發(fā),得到熒光光譜(圖2(a))。結(jié)果顯示，60℃及80℃的反應(yīng)溫度考查、及80℃下的重復(fù)實(shí)驗(yàn),衍生產(chǎn)物熒光強(qiáng)度穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。相同條件下進(jìn)行了DNS-Cl與對(duì)苯二胺、鄰氨基苯酚的熒光衍生,實(shí)驗(yàn)結(jié)果同鄰苯二胺。

80℃下,DNS-Cl-N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽熒光衍生反應(yīng)重現(xiàn)性良好(圖2(b)),進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光衍生條件。

進(jìn)行1×10-4mol/L濃度DNS-Cl-硝苯地平衍生物熒光光譜分析(圖2(c)),可知DNS-Cl可標(biāo)記硝苯地平分子中含氮雜環(huán)上的仲胺基。同理,DNS-Cl可有效標(biāo)記阿莫西林分子中的伯胺基、仲胺基,葉酸伯、仲、叔胺基,克拉霉素叔胺基,奧美拉唑伯胺基、仲胺基。

間隔取樣法分析37℃恒溫下DNS-Cl對(duì)阿莫西林衍生標(biāo)記的穩(wěn)定性,以DNS-Cl熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)462 nm處的熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖,得到光穩(wěn)定曲線圖3(a)。各時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度波動(dòng)較小,說明在阿莫西林體內(nèi)半衰期61.3 min時(shí)間范圍內(nèi),及其完全代謝排出體外之前,DNS-Cl均能有效標(biāo)記藥物分子,實(shí)現(xiàn)其代謝周期內(nèi)直觀可視的代謝路徑示蹤。

同理,硝苯地平體內(nèi)有效作用時(shí)間持續(xù)12 h,葉酸體內(nèi)半衰期約為40 min,克拉霉素緩釋片半衰期約為7 h，完全代謝時(shí)間需5 d,奧美拉唑體內(nèi)半衰期為0.5 h～1 h，有效血藥濃度可維持24 h。上述藥物代謝周期內(nèi),丹磺酰氯均能實(shí)現(xiàn)藥物分子的有效標(biāo)記及全程示蹤(圖3(b)～(e))。

2.2 細(xì)胞評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 計(jì)算DNS-Cl-硝苯地平及DNS-Cl-克拉霉素衍生產(chǎn)物對(duì)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304增殖抑制率,得到表1及表2。

得到IC50回歸方程[12]為

Y=2.746 438 66+0.575 664×X(Y表示概率單位,X表示lgc),Y=5即抑制率為50%時(shí), 反應(yīng)物濃度c=8 217 μmol/L,則IC50=8 217 μmol/L。

表2得到的IC50回歸方程為Y=2.633 155+0.544 912×X(Y表示概率單位,X表示lgc),Y=5，即抑制率為50%時(shí),反應(yīng)物濃度c=22 056 μmol/L,則IC50=22 056 μmol/L。

由表1，2可知,硝苯地平、克拉霉素?zé)晒鈽?biāo)記物在體外活細(xì)胞環(huán)境中毒性低,可用于活體研究中,在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

2.2.2 細(xì)胞熒光標(biāo)記 分別進(jìn)行DNS-Cl-硝苯地平、DNS-Cl-克拉霉素衍生產(chǎn)物與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304體外共孵育,低、中、高濃度梯度加樣,熒光共聚焦顯微鏡下拍攝成像,得到圖4，5。

圖3 熒光衍生產(chǎn)物光穩(wěn)定性(a) 丹磺酰氯-阿莫西林 (b) 丹磺酰氯-硝苯地平 (c) 丹磺酰氯-葉酸 (d) 丹磺酰氯-克拉霉素 (e) 丹磺酰氯-奧美拉唑(462 nm)Fig.3 Fluorescence Stability of (a) DNS-Cl-Amoxicillin, (b) DNS-Cl-Nifedipine, (c) DNS-Cl-Folic Acid, (d) DNS-Cl-Clarithromycinand (e) DNS-Cl-Omeprazole at 462 nm

c/μmol·L-1lgcOD1OD2平均值抑制率OD (對(duì)照)Y125.0002.0970.9780.8530.9160.8300.9240.102 250.0002.3980.7270.8620.7950.7090.9800.277 500.0002.6990.7960.8160.8060.7200.9410.235 1 000.0003.0000.7080.7590.7330.6480.9170.294 2 000.0003.3010.6140.6570.6350.5500.9160.400 4 000.0003.6020.7090.6590.6840.5980.9700.383

表2 DNS-Cl-克拉霉素衍生產(chǎn)物MTT數(shù)據(jù)Tab.2 MTT Experimental Data of DNS-Cl-Clarithromycin

圖4 丹磺酰氯-硝苯地平熒光衍生產(chǎn)物活細(xì)胞成像Fig.4 Living cells imaging of DNS-Cl-Nifedipine

圖5 丹磺酰氯-克拉霉素?zé)晒庋苌a(chǎn)物活細(xì)胞成像Fig.5 Living cells imaging of DNS-Cl-Clarithromycin

由圖4，5可看出，明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)完整,暗場(chǎng)下熒光衍生產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞,且熒光成像良好,可用于藥物在體內(nèi)代謝路徑示蹤,通過熒光成像技術(shù),為藥物分子的代謝路徑研究提供了直觀可視、安全有效的實(shí)驗(yàn)方法。

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)了遞進(jìn)式、多層次的實(shí)驗(yàn)方案,經(jīng)過簡(jiǎn)單含氮化合物、復(fù)雜含氮化合物、含氮藥物分別與DNS-Cl進(jìn)行衍生反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),建立了一種普遍適用的對(duì)含氨基藥物熒光標(biāo)記的方法。進(jìn)行丹磺酰氯與含氮藥物或化合物的衍生反應(yīng)時(shí),不需要添加催化劑,反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)時(shí)間短、適用性廣、操作簡(jiǎn)便快速。通過光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DNS-Cl對(duì)含氮化合物及藥物分子熒光標(biāo)記的穩(wěn)定性[10-11]及低毒性[8-9,12-15],DNS-Cl不僅可以實(shí)現(xiàn)藥物分子半衰期內(nèi)或代謝期內(nèi)的熒光穩(wěn)定標(biāo)記,而且可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平、分子水平的藥物作用代謝示蹤等,熒光標(biāo)記產(chǎn)物在體外活細(xì)胞環(huán)境中安全有效,反應(yīng)檢測(cè)直觀可視,具有較好應(yīng)用前景。未來工作將進(jìn)一步聯(lián)用色譜技術(shù),表征藥物作用效果、研究藥物作用機(jī)制、進(jìn)行藥物篩選等。