崔斌 劉曦 秦浙學 陳劍飛 李佳蓓 于世勇 黃嵐

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍心血管內科研究所，重慶400037)

血管內皮損傷是血管性疾病的始動環(huán)節(jié)，加速血管內膜修復進程是損傷性血管疾病防治的關鍵。自兼具干細胞及內皮細胞特性的內皮祖細胞(endothelial progenitor cell, EPC)發(fā)現(xiàn)以來，其在血管內膜修復中的作用受到廣泛關注[1-3]。而高齡冠心病患者循環(huán)中的EPC數(shù)量減少、功能不良，成為EPC自體移植在血管損傷性疾病臨床應用的瓶頸[4-6]。因此，明確老齡EPC增殖分化的調控機制具有重要意義。因參與細胞內糖代謝過程的重要物質糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在干細胞的增殖、分化和凋亡等多種重要生理過程中發(fā)揮重要作用[7-10]，我們推測GSK-3β可能在兼具干細胞特性EPC的增殖功能上發(fā)揮調節(jié)作用。本研究旨在觀察基因轉染抑制GSK-3β活性在老齡EPC增殖中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 選取清潔級老齡雄性Wster大鼠10只(鼠齡18周，體重500～550g)，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供并進行標準喂養(yǎng)，所有操作均符合相關倫理學規(guī)定。將大鼠分為基因轉染組及對照組，每組各5只?；蜣D染組為轉染表達催化GSK3β失活的GSK3β-KM基因的重組缺陷型腺病毒(pMSCV-GSK3β-KM)以抑制EPC的GSK3β活性，對照組為轉染表達攜帶綠色熒光蛋白的空病毒載體pMSCV-GFP。主要試劑包括：大鼠淋巴細胞分離液購于天津灝洋生物公司；優(yōu)質胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司；DiI-乙?；兔芏戎鞍?acLDL)購自Molecular probe公司；人纖維連接蛋白、二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)及FITC標記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)購自Sigma公司；VEGF 購自Pepro Tech公司；pGSK-3β、β-catenin 、cyclinD1及GAPDH兔抗大鼠抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG購自武漢博士德公司。細胞株293、含催化GSK3β失活的GSK3β-KM基因的重組逆轉錄病毒質粒pMSCV-GSK3β-KM由全軍心血管病研究所提供。脂質體lipofetamine2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC的分離、培養(yǎng)與鑒定 采用Ficoll密度梯度離心法分離老齡雄性Wister大鼠骨髓源性單個核細胞，接種于包被纖連蛋白的培養(yǎng)瓶中，置于含20%胎牛血清、50ng/ml VEGF的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3～4天更換培養(yǎng)液。采用AcLDL攝取法及FITC-UEA-I細胞免疫熒光法對EPC進行鑒定，熒光顯微鏡下DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色雙陽性細胞為正在分化的EPC[11]。

1.2.2 重組逆轉錄病毒的制備 將攜帶GSK3β-KM基因的pMSCV-GSK3β-KM或空病毒載體pMSCV-GFP采用脂質體lipofectamine2000介導法轉染至293細胞培養(yǎng)6小時。更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)72小時。收集病毒上清液，離心、沉淀、過濾后-70℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.3 基因轉染 取對數(shù)生長期的EPC分別加入表達催化GSK3β失活的GSK3β-KM基因pMSCV-GSK3β-KM或空病毒pMSCV-GFP的病毒上清液，再加入終濃度8mg/L的聚凝膠和無血清、無抗生素的DMEM。6小時后棄去轉染液，加入等量DMEM培養(yǎng)72h。熒光顯微鏡下觀察轉染后EPCs的熒光表達情況。

1.2.4 EPC增殖能力檢測 鏡下計數(shù)法：熒光倒置顯微鏡下對每組DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色雙陽性的EPC進行計數(shù)(計數(shù)5個隨機選擇的×200倍視野的EPC)。MTT檢測法：0.25%胰蛋白酶消化收集EPC，500μl培養(yǎng)液重懸細胞計數(shù)。將等量EPC接種到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時，加入MTT 6h后棄上清，加入二甲基亞砜終止反應，放置于微量振蕩器上充分震蕩10min，于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長處檢測吸光度值。

1.2.5 EPC細胞周期檢測 離心收集各組EPC，PBS洗滌2次，70%預冷乙醇固定，4℃過夜。PBS洗滌后EPC重懸于50μl/ml的碘化丙啶染液中,37℃避光孵育30min。流式細胞儀于488nm激發(fā)波長下進行熒光分選，測定分析細胞DNA含量分布，計算G0/G1期、S期及G2/M期細胞比例。每組實驗重復3次。

1.2.6 蛋白印跡法檢測蛋白表達 用蛋白裂解液分別提取各組EPC蛋白，測定蛋白總濃度。電泳分離、電轉膜、封閉后分別加入兔抗大鼠pGSK3β(1：1000)、β-catenin(1：1000)、cyclinD1(1：500)及GAPDH(1：1000)抗體，4℃過夜，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1：1000)孵育2小時。化學發(fā)光法顯影，凝膠成像分析儀行灰度掃描半定量分析蛋白表達量。

2 結果

2.1 EPC培養(yǎng)及鑒定 密度梯度法分離獲取的單個核細胞呈圓形，透光性好，48 小時后開始貼壁，逐漸生長呈梭形或紡錘形內皮樣細胞。熒光顯微鏡下可見DiI-acLDL和FITC-UEA-I染色雙陽性的細胞為正在分化的EPC，見圖1。

2.2 抑制GSK3β活性對EPC數(shù)量及增殖能力的影響 利用基因轉染方法將GSK3β-KM基因轉染至EPC，觀察抑制GSK3β活性對EPCs數(shù)量及增殖能力的影響。與對照組比較，基因轉染組EPC數(shù)量顯著增加(35.8±1.48 vs. 59.4±2.41,P<0.01)，見圖2A。基因轉染組EPC在490nm吸光度值與對照組比較差異性顯著(0.273±0.010 vs. 0.669±0.0776，P<0.01)，見圖2B。

2.3 抑制GSK3β活性對EPC細胞周期的影響 熒光激活細胞分離儀分析顯示基因轉染組EPC細胞周期中S期比例較對照組明顯增加,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

圖1EPC培養(yǎng)及鑒定

Figure1EPCcultureandidentification

注：A. EPC攝取DiI-acLDL表達紅色熒光；B. EPC與FITC-UEA-I結合表達綠色熒光(×200)
圖2抑制GSK3β活性增加EPC數(shù)量及增殖能力(n=5)

Figure2GSK3βinhibitonincreaseEPCnumberandproliferation

注：與對照組比較，①P<0.01

2.4 抑制GSK3β活性對EPC中Wnt下游信號通路的影響 為了明確抑制GSK-3β活性對EPC中Wnt下游信號通路的調節(jié)作用，我們采用蛋白印跡法測定pGSK3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表達。結果顯示，與對照組比較基因轉染組pGSK3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表達顯著增加(P<0.01)，見圖3。

表1 抑制GSK3β活性對EPC細胞周期的影響Table 1 The effect of GSK3β inhibition on EPC cell cycle

注：與對照組比較，①P<0.01

圖3 抑制GSK3β活性上調pGSK-3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表達Figure 3 GSK3β inhibition up-regulate the expression of pGSK-3β、β-catenin and cyclinD1注：與對照組比較，①P<0.01

3 討論

EPC從骨髓釋放至外周循環(huán)過程中逐漸分化為內皮細胞，參與損傷內膜的修復過程。研究學者積極探索EPC在細胞移植的優(yōu)勢作用，認為EPC可能作為種子細胞參與血管損傷性疾病的臨床治療。而老年冠心病患者成體循環(huán)中EPC數(shù)量不足及功能受限，成為EPC自體移植臨床應用的瓶頸。我們前期研究亦證實隨著年齡的增加，大鼠EPCs的數(shù)量及增殖能力逐漸受損。因此，明確調控老齡EPC增殖的機制有益于EPC移植的臨床應用。

GSK-3β是糖代謝通路中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，近來發(fā)現(xiàn)其不但參與糖代謝過程，而且在干細胞(胚胎干細胞、造血干細胞及神經干細胞等)的增殖、分化及凋亡過程中亦發(fā)揮重要作用。EPC兼具干細胞和內皮細胞特性，我們推測GSK-3β對EPC可能發(fā)揮相似的調控作用。結果發(fā)現(xiàn)基因轉染組EPC的數(shù)量及增殖能力較對照組顯著增加，可增強EPC移植在抑制血管內膜增生以及損傷血管再內皮化中的作用[13]。Hibbert B研究團隊的系列研究中進一步發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β活性還可加速藥物涂層支架所致的延遲再內皮化進程[17]。GSK-3β活性抑制在血管再內皮化中的加速作用可能緣于其顯著的促EPC增殖能力。本研究表明抑制GSK-3β活性可促進老齡EPC從靜止期向DNA合成期及有絲分裂期轉化。抑制GSK-3β活性可對Wnt下游信號通路發(fā)揮作用，通過蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β活性可顯著上調pGSK-3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表達。作為Wnt通路中傳遞信號的重要分子，β-catenin在細胞增殖中發(fā)揮核心調控作用。Wnt信號通路激活后細胞內GSK-3β的活性被抑制，減弱了對β-catenin的磷酸化作用。未磷酸化的β-catenin 在胞質中積累,并轉運至胞核,繼而同轉錄因子TCF/LEF結合形成異源二聚體,激活TCF/LEF活性，啟動下游靶基因cyclinD1、c-myc等的轉錄和表達[18-20]。主要分布于細胞核中的CyclinD1是重要的細胞周期調控蛋白，參與細胞的增殖。我們研究發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β活性可通過激活Wnt/β-catenin信號通路, 上調β-catenin及CyclinD1的表達，促進EPC細胞周期S期比例增加，繼而增強EPC的增殖能力。上述結果與我們前期采用氯化鋰藥物干預抑制GSK-3β活性對EPC增殖能力作用相似。因此推測，無論藥物干預還是基因轉染抑制GSK-3β活性均可促進EPC的增殖活性。

4 結論

利用基因轉染抑制GSK-3β活性可激活Wnt/β-catenin信號通路、促進老齡大鼠EPC增殖，為有效擴增老年患者自體EPC治療血管損傷性疾病的臨床應用提供實驗基礎。