殷玉蓮 張衛(wèi)紅 周悅 葉媚娜 陳紅風*

1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)乳腺科，上海 200032 2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院乳腺外科，上海 201901

乳腺癌是威脅當代女性身心健康的常見惡性腫瘤之一，且其發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。研究顯示，乳腺癌患者中約有60%～75%患者激素受體(Hormone receptor，HR)陽性，內(nèi)分泌治療是常見的有效治療方式。其中，芳香化酶抑制劑(Aromatase Inhibitor，AI)已成為絕經(jīng)后激素受體陽性乳腺癌的標準輔助內(nèi)分泌治療。 AIs相比于他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)能進一步降低乳腺癌患者復(fù)發(fā)風險，使其獲得更長的生存期[3]。但AI治療所帶來的骨代謝異常、全身骨關(guān)節(jié)酸痛、骨質(zhì)疏松、甚至骨折等直接影響了患者應(yīng)用AI治療的依從性及日常生活質(zhì)量。這一系列變化被稱為芳香化酶抑制劑相關(guān)骨丟失(Aromatase Inhibitors-associated Bone Loss，AIBL)。本研究通過隨機對照的方法探究補腎壯骨方防治芳香化酶抑制劑相關(guān)骨丟失(AIBL)的防治作用及安全性，分析其與ERα基因rs9340799、rs2 234693兩個位點單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的相關(guān)性，試從基因?qū)用鏋檠a腎壯骨方防治AIBL的機制研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 分組方法及臨床資料

116例均來自上海中藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)乳腺科2015年10月至2017年4月期間門診及住院的乳腺癌術(shù)后AIs治療的患者。并設(shè)分層條件：①絕經(jīng)時間≤10年、>10年；②接受AIs治療時間<1年、1-2年。隨機均分為2組，臨床基本資料分析，見表1。

1.2 ERα基因SNPs位點檢測

入組對象均抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，將其置于無菌無酶的EDTA抗凝試管，存放于-20 ℃。引物均由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計并合成，對目標片段進行PCR擴增[3]，ERα基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳觀察圖，見圖1。

表1 治療組與對照組臨床基本資料分析Table 1 The basic clinical data of the treatment group and control group

圖1 ERα基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳觀察圖Fig.1 The agarose electrophoresis map of PCR product of ERα gene

所有位點的基因測序由生工生物工程(上海)有限公司進行統(tǒng)一測定，測序儀型號為3730XL(美國ABI)，結(jié)果使用Seqman、Chromas軟件分析，見圖2、3。

圖2 ERα基因rs9340799位點測序圖Fig.2 The sequencing map of rs9340799 site of ERα gene

圖3 ERα基因rs2234693位點測序圖Fig.3 The sequencing map of rs2234693 site of ERα gene

1.3 骨密度及骨代謝指標測定

采用雙能X線吸收法測量腰椎(L1-L4)、股骨BMD(生產(chǎn)公司：HOLOGIC，型號：QDR4500)，按常規(guī)腰椎、股骨檢測條件及體位，并對年齡、BMI指數(shù)等影響B(tài)MD的因素進行修正。每日開機后均用模體校正，錯誤率為0.5%，常年錯誤率<1%。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定I型前膠原氨基前端肽以及β-I型膠原羧基端肽。

1.4 治療與實施

所有患者給予標準劑量的第三代AIs(阿那曲唑、來曲唑、依西美坦)，同時常規(guī)補充鈣劑和維生素D。

對照組：辨證施用中藥湯劑治療，組方中避免使用補腎中藥(即使研究中辨證為腎虛的患者，既隨機分入對照組，故組方中規(guī)避使用補腎功效的中藥)。治療組：辨證中藥湯劑的基礎(chǔ)上加用補腎壯骨方(仙靈脾15 g、補骨脂15 g、骨碎補15 g、菟絲子15 g、淮牛膝30 g)。用法用量：由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院煎藥室煎制，水煎400 mL，日1劑，分早晚2次，餐后1小時溫服。3個月為1個療程，觀察2個療程。

1.5 安全性檢測

觀測一般生命體征、血常規(guī)、肝腎功能等血液指標及可能發(fā)生的不良反應(yīng)。治療前后均檢測一次性激素水平。觀察有無骨折的發(fā)生，腫瘤有無進展及其他用藥期間的不適反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計方法

采用PLINK-doc-1.04對患者測序結(jié)果進行Hardy-Weinberg遺傳基因分布平衡檢驗。應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各基因亞型組間計量和計數(shù)資料差異比較采用t檢驗和卡方檢驗。若P<0.05，說明比較具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 研究對象檢測指標基線比較見表2。

表2 兩組治療前腰椎、股骨骨密度、PINP、β-CTX基線比較Table 2 Comparison of BMD of the lumbar spine and femur, PINP, and β-CTX between the two groups before the treatment

2.2 治療前兩組基因型分布的比較

據(jù)等位基因的實際和理論頻數(shù)，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，所有患者ERα基因rs9340799、rs2 234 693位點分布及等位基因頻率，見表3。兩位點各基因型分布(P均>0.05)，樣本具有群體代表性。分析治療組與對照組ERα基因rs9340799、rs2 234 693位點SNPs各基因型分布發(fā)現(xiàn)，兩組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 ERα基因rs9340799、rs2 234 693位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Table 3 Hardy-Weinberg genetic balance test of ERα gene rs9340799 and rs2234693

2.3 治療后兩組骨代謝相關(guān)指標變化

治療6個月發(fā)現(xiàn)治療組腰椎BMD值、T值較治療前升高(P>0.05)；對照組則均下降(P<0.05)；治療6個月后，治療組的腰椎BMD值、T值均明顯高于對照組(P<0.05)。治療組和對照組的股骨BMD值、T值治療前后比較，無統(tǒng)計學意義；治療6個月治療組高于對照組(P<0.05)，見表4。治療6個月后，腰椎BMD值不變或升高的治療組為36例，對照組為16例；治療組下降22例，對照組42例，兩組有效率比較(27.59% vs 62.07%)(P<0.001)。治療6個月后，股骨BMD值不變或升高的治療組45例，對照組為17例，兩組有效率比較(29.31%vs77.59%)(P<0.001)。

表4 治療6個月后兩組腰椎、股骨骨密度的變化Table 4 The changes of BMD of the lumbar spine and femur after 6-month treatment

治療組骨形成指標PINP在治療期間呈上升趨勢，治療6個月與治療前組內(nèi)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.013)。對照組治療3個月PINP升高，(P=0.692)；治療6個月則下降(P=0.806)。治療6個月治療組的PINP明顯高于對照組(P=0.045)，見圖4。治療組骨重吸收指標β-CTX在治療3個月、治療6個月呈下降趨勢，對照組β-CTX則出現(xiàn)上升趨勢。治療3個月，2組間比較無統(tǒng)計學差異(P=0.081)；治療6個月2組間比較，治療組β-CTX低于對照組，(P<0.001)，見圖5。

圖4 兩組PINP變化趨勢圖(ng/mL)Fig.4 PINP trend in the wo groups (ng/mL)

圖5兩組β-CTX變化趨勢圖(pg/mL)Fig.5 β-CTX trend in the two groups (pg/mL)

2.4 治療后 ERα基因SNPs與骨密度的關(guān)系

統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)分組情況(group)(P<0.0001)、服藥時間(P<0.05)、ERα基因rs9340799位點SNPs(gene1)(P<0.05)、ERα基因rs2234693位點SNPs(gene2)(P<0.05)對患者的腰椎BMD值變化有關(guān)。其中A、T純合型患者治療前后腰椎BMD值差異，比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而G、C等位基因的患者腰椎BMD值治療后呈下降趨勢(P<0.05)，見表5。治療組各基因亞型的腰椎BMD值均高于對照組(P<0.01)，見表6。ERα基因SNPs與股骨骨密度、PINP與β-CTX治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 安全性評估

觀察發(fā)現(xiàn)，治療前后所有患者的血常規(guī)、肝腎功能均在正常范圍?；颊哐宕贫妓骄诮^經(jīng)后參考范圍內(nèi)，治療后兩組組間比較，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組患者的促卵泡刺激素亦未見明顯異常，治療后兩組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5 治療前后ERα基因SNPs各基因型與腰椎BMD值變化Table 5 The change of ERα gene SNPs and lumbar spine BMD before and after the treatment

表6 兩組間治療前后ERα基因SNPs各基因型與腰椎BMD值變化Table 6 Changes of BMD of the lumbar spine for each genotype of ERα gene SNPs before and after the treatment

3 討論

3.1 ERα基因SNPs與AIBL的關(guān)系

乳腺癌術(shù)后應(yīng)用AIs治療的患者，均為絕經(jīng)期女性，流行病學調(diào)查表明[4]，絕經(jīng)期女性會出現(xiàn)不同程度的骨代謝異常，這可能與其體內(nèi)雌激素的缺乏有關(guān)。AIs治療則是通過抑制芳香化酶，減少體內(nèi)雌激素，從而提高療效，但同時也破壞了骨吸收和骨形成間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨代謝異常的發(fā)生。多項大型臨床研究已證實，AIs治療在帶來獲益的同時，對骨代謝異常的發(fā)生帶來較高風險[5]。ATAC[6]及BIG1-98[7]試驗已經(jīng)證實5年AI的療效明顯優(yōu)于5年TAM治療。MA.17R研究[8]納入約2 000例完成5年左右內(nèi)分泌治療的激素受體陽性絕經(jīng)后乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)AI組中骨折和新發(fā)骨質(zhì)疏松的風險增高。因此如何權(quán)衡利弊，防治AIBL的發(fā)生尤為重要。

隨著研究的深入，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測已作為研究手段被應(yīng)用到臨床及科研中。根據(jù)ERα基因1號內(nèi)含子對ERα的表達與功能的決定性影響，而rs2234693(XbaI A351G)[9]、rs9340799(PvuII T397C)[10]即位于其1號內(nèi)含子上，且相關(guān)研究已證實其與骨質(zhì)疏松相關(guān)。汪曾榮[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)XX(rs9340799)位點多態(tài)性對與老年女性髖關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松有關(guān)。另一項研究[12]則證實，ERα基因位點基因多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥明顯相關(guān)。既然ERα基因以上兩位點SNPs與普通人群中的骨代謝異常有關(guān)，而涉及乳腺癌術(shù)后應(yīng)用AI這一特殊人群骨代謝異常的基因多態(tài)性研究尚存在空白。故本研究以其為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個位點各基因型及等位基因分布頻率與近年國內(nèi)相關(guān)文獻類似[3，13]，同時ERα基因rs9340799與rs2234693位點SNPs對腰椎BMD值變化趨勢存在影響，C、G等位基因患者的腰椎BMD值在治療后的下降趨勢較純合型A、T等位基因患者更明顯。由此可見，AIs治療加重了骨代謝異常，其中對純合型A、T等位基因患者的影響較小，而攜帶有C、G等位基因的患者更易發(fā)生AIBL。

3.2 補腎壯骨方防治芳香化酶抑制劑引起的骨代謝異常臨床療效的關(guān)系

目前西醫(yī)對于骨代謝異常的治療，主要以補充鈣和維生素D為基礎(chǔ)。但單純補充鈣和維生素D對骨折等不良反應(yīng)的發(fā)生不能完全預(yù)防。因而在治療中會搭配其他的抗骨質(zhì)疏松藥物，例如雙膦酸鹽、雌激素替代療法、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等。但各類藥物各有利弊，為治療帶來局限性。在防治骨代謝異常方面，中醫(yī)藥具有一定優(yōu)勢。中醫(yī)認為，骨代謝異常的發(fā)生與“腎、脾、肝”三臟有關(guān)。經(jīng)辨證論治，主以補腎、健脾、疏肝為法。針對AIs治療的絕經(jīng)后乳腺癌患者，為腫瘤術(shù)后狀態(tài)，體虛為本；且患者天癸已竭，腎精衰敗；同時AIs治療進一步降低了雌激素水平，加重了“腎虛”。故補腎法在治療AIBL中尤為重要。本研究充分考慮患者“腎虛”為本的特點，以補腎為根本治法，結(jié)合導(dǎo)師臨床用藥經(jīng)驗及前期研究結(jié)果，組方補腎壯骨方，由仙靈脾15 g、補骨脂15 g、骨碎補15 g、菟絲子15 g、淮牛膝30 g組成。其中淫羊藿“味甘氣香，性溫不寒，能益精氣，乃手足陽明、三焦、命門藥也，真陽不足者宜之?！惫室云錇檠a腎陽之要藥。補骨脂其性溫味辛，歸腎經(jīng)，具有補腎助陽的作用。骨碎補其性溫味苦，歸于肝腎兩經(jīng)，主要有補腎強固、續(xù)傷止痛的功效。菟絲子性味甘平，歸肝、腎、脾經(jīng)，稟氣中和平，善補而不峻，益陰而固陽，乃上品之藥。牛膝入肝腎兩經(jīng)，作為引經(jīng)藥，引陽下行溫陽補腎。此方補益腎中陰陽，同時引藥入經(jīng)，共湊補腎強骨之用。

研究發(fā)現(xiàn)治療組能增加患者腰椎、股骨BMD，提高血清骨形成指標PINP水平，降低血清骨重吸收指標β-CTX水平，且療效優(yōu)于對照組。補腎壯骨方對于各基因亞型均可增加其腰椎BMD值。本研究檢測患者治療前后血常規(guī)與肝腎功能均未出現(xiàn)異常，血清雌二醇水平和促卵泡刺激素，治療前后差異無統(tǒng)計學意義。已有臨床研究結(jié)果[14]證實補腎中藥具有一定抗腫瘤、抗雌激素樣作用，并能夠安全有效的改善骨代謝[15]。中醫(yī)藥治療符合中醫(yī)理論辨證施治，是具有安全性的。

總之，補腎壯骨方能夠安全有效地維持骨密度并改善骨代謝異常，對于AIBL具有一定防治作用。ERα基因rs9340799與rs2234693位點中C、G等位基因可能是AIBL的易感基因型，補腎壯骨方可改善AI引起的不良反應(yīng)，為絕經(jīng)期乳腺癌患病群體的精準治療提供依據(jù)。研究中患者腰椎BMD和股骨BMD結(jié)果存在差異，這可能與不同部位的骨質(zhì)狀況有關(guān)，可能還存在測量方法的誤差。今后需進一步擴大樣本量，對中醫(yī)藥理論補腎中藥防治骨代謝異常的機制機理進行探索。