李浩川，曲彥志，楊繼偉，崔麗洋，毛熙嵐，劉宗華

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基于核磁共振的玉米不同籽粒類型單粒質量和含油率分析

李浩川，曲彥志，楊繼偉，崔麗洋，毛熙嵐，劉宗華※

（河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002）

針對現(xiàn)有玉米單倍體核磁共振分選系統(tǒng)基于一個含油率閾值，無法對胚敗育籽粒和單倍體籽粒正確分選的問題，分別對玉米生物誘導產(chǎn)生的二倍體、單倍體和胚敗育3種不同籽粒類型的單粒質量和含油率進行分析，提出了利用籽粒含油率雙閾值提高單倍體正確識別率的分選方法。該研究以2個普通玉米雜交種和3個自交系為母本，以高油型誘導系為父本，進行生物誘導產(chǎn)生的3種不同類型籽粒為研究對象，利用核磁共振分選系統(tǒng)分別對不同類型籽粒的單粒質量和含油率進行測定，結果表明：單粒質量整體表現(xiàn)為單倍體>二倍體>胚敗育，除二倍體籽粒與胚敗育籽粒間存在極顯著差異外，其他籽粒類型間差異不顯著；不同類型籽粒的單粒質量平均變異系數(shù)為16.62%，并且每個材料的3種籽粒類型間出現(xiàn)較大的重疊區(qū)域。而不同類型籽粒含油率整體表現(xiàn)為二倍體>單倍體>胚敗育，變異性以二倍體最小，平均變異系數(shù)僅為12.52%，其次是單倍體，而胚敗育籽粒最高（34.14%），但其含油率最低且均≤2%；每個材料各自的3種類型籽粒間含油率呈現(xiàn)梯度分布，存在較明顯的界限。由此可見，利用籽粒含油率能夠區(qū)分玉米生物誘導的3種不同籽粒類型，而單粒質量則不能；通過設置二倍體籽粒的最小含油率為上限，胚敗育籽粒的最大含油率為下限，利用含油率的雙閾值可提高單倍體的正確識別率，為玉米生物誘導單倍體高效自動化分選提供依據(jù)。

核磁共振；作物；玉米；單倍體；單粒質量；油分含量

0 引 言

自交系選育是培育玉米新品種的核心環(huán)節(jié)，常規(guī)選系的方法需要至少7代連續(xù)自交才能達到99%以上的純合率，選育周期長，效率低，難以滿足玉米商業(yè)化育種的需求。而單倍體育種技術只需2代就可獲得100%的純系，顯著縮短了育種周期，提高了育種效率，已成為現(xiàn)代玉米育種的三大核心技術之一[1]。單倍體的產(chǎn)生、加倍及雙單倍體（doubled haploid，DH）的應用是單倍體育種技術的3個關鍵環(huán)節(jié)，而單倍體的產(chǎn)生是單倍體育種技術利用的前提。產(chǎn)生單倍體的途徑較多，可以通過花藥離體培養(yǎng)、未授粉子房、花粉輻射等方法，但這些方法不僅受基因型的依賴性較強而且操作也比較繁瑣，因此生物誘導的方法備受青睞。生物誘導單倍體包括孤雄生殖和孤雌生殖2種方式，最早在不定配子體突變體W23（）中發(fā)現(xiàn)，以該材料做母本可誘導產(chǎn)生1%～2%的孤雄生殖單倍體[2]，由于純合體表現(xiàn)出雄性不育，必須在雜合狀態(tài)下才能保持，而雜合體自交只能產(chǎn)生1/4的純合體，導致其繁殖困難，因此無法進行規(guī)?；瘧?。目前，生產(chǎn)上利用單倍體產(chǎn)生的主要途徑是生物誘導孤雌生殖，其基本過程是以期望獲得單倍體的材料為母本，以誘導系為父本進行雜交，在雜交當代的果穗上就會產(chǎn)生一定比例的單倍體。單倍體籽?？焖贉蚀_的挑選是單倍體育種技術的先決條件，也是單倍體工程化育種的重要環(huán)節(jié)。因此，如何從大批量雜交果穗中將單倍體高效地挑選出來已是生物誘導孤雌生殖單倍體利用面臨的重要問題。單倍體鑒定常用方法主要是利用遺傳標記基因能在籽粒頂部及胚部產(chǎn)生的Navajo紫色標記性狀進行人工鑒定，也有利用形態(tài)學、細胞學、分子標記、射線照射、質量鑒定等方法進行田間或室內(nèi)鑒定[3-4]，但是這些方法成本較高，且效率低。為了提高單倍體挑選的效率，初步實現(xiàn)了單倍體的自動化分選。目前，玉米生物誘導孤雌生殖單倍體的自動化分選主要是基于光譜信息[5-6]、成像識別[7]及籽粒成分[1]等方法對籽粒進行鑒定分選。宋鵬等[7]利用計算機視覺系統(tǒng)基于胚部是否有表達的色素標記進行單倍體分選，對于胚面朝上的籽粒正確識別率可達90%，分選成功率可達80%，但對于胚面朝下的籽粒，成像后就無法進行識別，為了解決這個問題，李衛(wèi)軍等[8]基于計算機視覺加上斜面翻滾部件，利用高速照相機，實現(xiàn)籽粒多次信息獲取，單倍體正確識別率可達95%；除此之外，劉金等[9]利用可見光漫透射光譜以及Brett等[10]利用顏色標記與熒光顯微光譜學結合的方法對單倍體與二倍體進行識別，單倍體的正確分選率均在80%以上。盡管這些方法得到了一定改進，但仍受基因表達的限制，尤其是存在抑制基因的硬粒玉米材料中，Navajo標記的表達受到抑制，因此很難利用上述方法實現(xiàn)分選?；诖?，中國農(nóng)業(yè)大學率先開展了基于籽粒含油率的單倍體自動化分選研究，成功選育出第一個高油型誘導系農(nóng)大高油高誘1號的基礎上并首次提出利用高油誘導系花粉的直感效應進行單倍體鑒定[11-13]，這一方法的可行性也進一步得到證實[14]，通過籽粒含油率利用核磁共振實現(xiàn)了單倍體的自動化分選[15]，這種簡單可靠的識別方法大大提高了單倍體的分選效率[16]，并已在育種中應用。確定含油率閾值是利用油分含量進行單倍體鑒定的一個關鍵環(huán)節(jié)，將直接影響到單倍體分選的正確識別率。研究結果表明含油率閾值應由單倍體漏選率、誤選率和值3種因素共同決定[17]。李浩光等[18]也提出了基于最小平方誤差的方法進行單倍體分選，只需對少量的單倍體和二倍體籽粒含油率進行測定，然后通過構建鑒別單倍體模型就能迅速確定含油率閾值，二倍體正確拒識率及單倍體正確識別率的均值達到90%以上。這些基于油分利用核磁共振進行單倍體分選的研究僅設置一個含油率閾值進行單倍體分選。然而，利用誘導系進行雜交誘導時，在誘導果穗上均會產(chǎn)生胚乳敗育和胚敗育的籽粒[19]，且父本誘導系的誘導能力與籽粒敗育程度存在高度相關[20]，因此，在嚴格授粉條件下，誘導當代的果穗上有正常雜交的二倍體籽粒、單倍體籽粒、胚敗育籽粒和胚乳敗育籽粒4種類型。胚乳敗育籽粒由于生長發(fā)育過程中停滯，胚乳中積累的有機物較少，表現(xiàn)出小而輕的籽粒，通過篩子即可篩出；而胚敗育籽粒，由于胚發(fā)育不正常，胚乳能正常發(fā)育，從而引起籽粒油分含量極低，在機械分選過程中胚敗育籽粒常常與單倍體籽?；煸谝黄?，導致單倍體的誤選率較高，需要進行人工二次分選，增加了分選成本。因此，進行單倍體與胚敗育籽粒和二倍體的識別是單倍體自動化分選的一個重要內(nèi)容。本研究以高油型誘導系為父本，普通玉米為母本，通過分析生物誘導孤雌生殖過程中二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒3種不同類型籽粒的單粒質量和含油率，以期為單倍體準確識別提供理論依據(jù)，提高核磁共振分選單倍體的準確率，進而促進單倍體育種技術的工程化進程。

1 材料與方法

試驗于2016年冬在海南河南農(nóng)業(yè)大學試驗基地以高油誘導系CHOI2（含油率為9.21%）和 CHOI2/CAUHOI （含油率為8.02%）為父本，以普通玉米雜交種LN16841（C521×L56M，含油率為3.24%）和LN16842（L217×LHC1，含油率為3.09%）以及自交系E28（含油率為3.92%）、鄭22（含油率為3.46%）和鐵C8605-2（含油率為3.88%）為母本，進行人工授粉（如表1）。成熟后收獲誘導果穗10穗以上，分別按材料混合脫粒。依據(jù)標記性狀進行二倍體、單倍體和胚敗育3種不同類型籽粒的挑選，籽粒頂部和胚均有紫色的籽粒為二倍體籽粒；籽粒頂部有紫色標記，胚部無色的籽粒為單倍體籽粒[21]；胚乳正常，籽粒頂部糊粉層有紫色標記，胚部凹陷沒有規(guī)則形狀胚的籽粒為胚敗育籽粒（圖1）。利用上海紐邁科技有限公司的核磁共振分選系統(tǒng)（型號：OnlineMR20-015V）對3種不同類型的籽粒分別進行單粒質量和含油率測定。利用 SPSS19.0進行統(tǒng)計分析。

表1 雜交組合來源

圖1 生物誘導產(chǎn)生的3種不同籽粒類型

2 結果與分析

2.1 不同類型籽粒質量與含油率均值分析

不同遺傳背景材料誘導后各自不同類型籽粒的單粒質量和含油率的均值見表2。不同類型籽粒的平均質量相差不大，對于正常受精的二倍體來說，單交種LN16841的單粒質量為0.25 g，單交種LN16842和自交系鐵C8605-2的二倍體單粒平均質量均為0.26 g，最大的為E28，其單粒質量為0.30 g；不同材料單倍體籽粒的單粒質量以鐵C8605-2最小，僅為0.23g，E28最大，高達0.29 g；而胚敗育籽粒的單粒質量的變異范圍為0.22～0.27 g。二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒3種類型的單粒質量均值分別為0.26、0.27和0.24 g，整體表現(xiàn)為單倍體>二倍體>胚敗育；測驗結果表明（表3），只有二倍體與胚敗育兩者之間單粒質量達極顯著水平，而二倍體與單倍體間、單倍體與胚敗育籽粒間差異均不顯著。但雜交種LN16841、LN16842及自交系鄭22的單倍體籽粒平均單粒質量比二倍體籽粒高0.01～0.02 g。這可能是因為單倍體籽粒由于胚體積較小，相應胚乳庫容變大，有利于更多淀粉的積累[22-23]；而二倍體籽粒的胚，由于受高油父本的花粉直感效應影響，誘導當代籽粒胚較大，油分含量增多，胚乳體積變小，淀粉積累較少[24]，從而導致單倍體籽粒質量略高于二倍體。

表2 不同材料不同籽粒類型單粒質量與油分平均值

3種不同類型籽粒油分含量中以二倍體籽粒油分含量最高，平均含油率高達5.93%，其次是單倍體，含油率為3.37%，而胚敗育籽粒含油率僅為0.89%；經(jīng)過測驗（表3），三者之間均存在極顯著差異。不同材料間二倍體籽粒油分含量的變異較大，以自交系鐵C8605-2的二倍體籽粒油分含量最高，含油率為6.52%，雜交種LN16841最低，其二倍體含油率僅為5.19%；單倍體籽粒油分含量變異較小，以E28油分最高（3.79%），LN16842最低（3.04%）。全部籽粒中均以胚敗育籽粒的油分含量最低，變異幅度也最小，LN16842的胚敗育籽粒含油率最高，僅為1.04%。由此可見，普通玉米與高油誘導系雜交后由于花粉直感效應可以提高雜交當代籽粒含油量，不同類型籽粒油分含量差異均在2個百分點以上，因此，設置合理的含油率參數(shù)比設置單粒質量參數(shù)實現(xiàn)單倍體的自動化分選更可靠。

表3 不同籽粒類型間單粒質量與含油率均值t測驗

注：**代表在0.01水平上差異顯著。

Note: ** represents significant difference at 0.01 level.

2.2 不同材料各類型籽粒質量和含油率變異性分析

不同材料經(jīng)過高油誘導系誘導產(chǎn)生的二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒3種類型單粒質量和含油率變異系數(shù)如表4。結果表明：不同遺傳背景材料的變異性較大，來自LN16841不同類型籽粒的單粒質量平均差異最大，為19.76%，其次是鄭22和LN16842，為19.60%左右，而E28的變異最小，僅為11.29%；不同類型籽粒間的單粒質量平均變異系數(shù)以胚敗育籽粒為最高，達17.85%，其次是單倍體籽粒，而二倍體籽粒的單粒質量變異系數(shù)最小，僅為15.82%。對含油率而言，不同材料間籽粒含油率的平均變異均在20%左右；不同籽粒類型間變異性較大，胚敗育籽粒的含油率平均變異系數(shù)高達34.14%，單倍體籽粒的平均變異系數(shù)為16.02%，而二倍體籽粒的最小，僅為12.52%；由此可推斷胚的敗育過程各籽粒并非同步，可能在胚發(fā)育過程中的任何時期均可發(fā)生敗育，敗育早的籽粒，含油率較低，敗育晚的籽粒含油率較高；整體而言，盡管單粒質量的平均變異系數(shù)（16.62%）小于含油率的平均變異系數(shù)（20.90%），且每兩類籽粒間的平均變異系數(shù)差值也小于對應材料含油率平均變異系數(shù)的差值，但對于每個不同遺傳背景材料的不同類型籽粒變異范圍而言，各個材料在單粒質量上均存在較大的重疊區(qū)域（圖2），而含油率在每個材料的3類不同籽粒間存在較明顯的界限（圖3），由此可知，利用籽粒油分含量作為判斷二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒是可行的。

表4 不同籽粒類型的單粒質量和含油率變異性分析

圖2 不同材料間3種類型籽粒單粒質量變異范圍

圖3 不同材料間3種類型籽粒含油率變異范圍

2.3 不同籽粒類型單粒質量和含油率分布

不同基因型材料所產(chǎn)生的二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒含油率呈明顯的梯度分布（圖4）。正常雜交的二倍體籽粒位于最上部，單倍體籽粒位于中間，而敗育籽粒位于最下方，很容易劃分出3個不同的類別。而單粒質量呈現(xiàn)連續(xù)分布，且3類籽粒間沒有明顯的特征分布。由此可見，籽粒含油率是進行雜交二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒區(qū)分的更好指標，而單粒質量只有二倍體與胚敗育籽粒間存在顯著差異，但是由于其在任兩類籽粒間的分布出現(xiàn)嚴重交叉，不能對生物誘導的3種不同籽粒類型進行準確分選。因此，基于籽粒含油率可利用核磁共振將生物誘導的3種不同類型籽粒進行識別和區(qū)分，不受基因表達和籽粒胚面朝向的影響。由于3類籽粒間含油率呈明顯的梯度分布且有較清晰的界限，可設二倍體籽粒含油率的最小值為上限，胚敗育籽粒含油率的最大值為下限進行單倍體識別，只要在這2個閾值之間就可判定為單倍體；由于一些母本材料的單倍體籽粒和二倍體籽粒之間以及單倍體籽粒和胚敗育籽粒之間也存在一定的重疊區(qū)域，可取重疊區(qū)域的均值作為上限閾值和下限閾值，以適當減小單倍體的漏選率和誤選率。根據(jù)本研究結果，通過設置合適的上限與下限雙閾值，利用核磁共振就可以有效地從3類不同籽粒中分選單倍體，降低單倍體的誤選率，減少人工二次分選單倍體中混入胚敗育籽粒的工作量。

圖4 不同籽粒類型含油率和單粒質量的分布

3 結 論

本研究基于核磁共振分選系統(tǒng)，利用玉米高油型誘導系和不同遺傳背景的普通玉米材料進行雜交所產(chǎn)生的正常受精二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒3種籽粒類型進行單粒質量和含油率的分析，主要結論如下：

1）玉米不同遺傳背景材料經(jīng)過高油誘導系誘導后所產(chǎn)生的3種不同籽粒類型，單粒質量只在二倍體與胚敗育2種籽粒類型間存在極顯著差異，二倍體與單倍體之間以及單倍體與胚敗育籽粒間的單粒質量差異均不顯著；而含油率在任2種不同類型籽粒間均存在顯著差異。

2）單粒質量呈現(xiàn)連續(xù)分布，3類籽粒間沒有明顯的界限且存在較大的重疊區(qū)域；而油分的分布呈現(xiàn)階梯狀，正常雜交的二倍體位于最上部，單倍體籽粒位于中間，敗育籽粒位于最下方，不同籽粒類型間存在較明顯的界限，很容易將3種不同類型籽粒進行識別。

3）籽粒含油率是區(qū)分二倍體籽粒、單倍體籽粒和胚敗育籽粒的更好指標。以二倍體籽粒含油率的最小值為上限，以胚敗育籽粒含油率的最大值為下限，利用含油率的雙閾值可提高單倍體的正確識別率，可準確地分選出胚敗育籽粒，極大地減少人工二次分選的工作量，為基于核磁共振系統(tǒng)進行單倍體自動化分選提供理論支撐。

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Li Haochuan, Qu Yanzhi, Yang Jiwei, Cui Liyang, Mao Xilan, Liu Zonghua※

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Maize haploid breeding as an important technology of modern breeding programs can shorten breeding cycles and enhance the breeding efficiency. The method of haploid produced by in vivo has become a routine process and has been adopted widely in maize breeding. The rapid and accurate recognition of haploid kernels is a prerequisite for in vivo haploid breeding technology. Therefore, how to efficiently select haploid seeds from mass hybridization kernels has been an issue during the use of parthenogenetic haploid. At present, spectral information and image recognition based on the geneexpressing Navajo marker in kernels were usually used to automatically sort haploids in maize, but the expression of genewere significantly depended on the maternal genetic backgrounds, it is unavailable for some flint germplasms with the presence of a supressor. With the development of inducers with high oil and high inducing rate, the automatic sorting of maize haploid kernels become a reality based on nuclear magnetic resonance (NMR). The embryo of haploid only developed from female gamete without the fusion of the sperm cell, so the oil content of haploid kernels is usually lower than that of diploid kernels because of xenia effect. Presently, most studies only set one threshold of oil content to identify haploid and diploid kernels based on NMR. However, there are some embryo abortion kernels with very lower oil content during the process of haploid induction, it is difficult to make distinction among diploid, haploid and embryo abortion kernels based on one threshold of oil content using NMRsorting system. In this paper, the single kernel weight and oil content of diploid, haploid and embryo abortion kernels by in vivo induction were analyzed, respectively, a new concept of increasing the correct discrimination rate of haploid based on two thresholds of oil content was developed. Three different types of kernels were produced by in vivo induction using two common maize hybrids and three inbred lines as females and inducers with high oil content as the males. The measurement of single kernel weight and oil content for three types of kernels were carried out by NMR sorting system. The result showed that the rank of the single kernel weight of different grain types was haploid > diploid > embryo abortion kernels, the highly significant difference existed between diploid and embryo abortion kernels, but there was no difference between diploid and haploid kernels, haploid and embryo abortion kernels.The variation coefficient of the average performance of single kernel weight was 16.62%, lager overlaps appeared among three different types of kernels. The oil content showed that the diploid > haploid > embryo abortion kernels. The coefficient of variation of oil content for diploid kernels was the lowest with only 12.52%, followed by haploid kernels, the highest was embryo abortion kernels with 34.14%, but the oil content was not more than 2% for all the embryo abortion kernels. The step distribution with obvious boundaries for oil content among the three different grain types was found. It indicated that the oil content can be used to recognize among three different types of kernels, but the single kernel weight cannot be as a sorting standard. According to the oil content, minimum of diploid and maximum of embryo abortion kernels were set respectively as the upper and lower limit value to form double thresholds, which could improvethe rate of correct discrimination for haploid and provide a reference during the process of automatically sorting haploid kernels with high efficiency.

nuclear magnetic resonance; crops; maize; haploid; single kernel weight; oil content

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.20.023

S24

A

1002-6819(2018)-20-0183-06

2018-04-23

2018-08-01

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0101205）資助

李浩川，博士，副教授，主要從事玉米遺傳育種研究。Email：lihaochuan1220@163.com

劉宗華，博士，教授，主要從事玉米遺傳育種研究。Email：zhliu100@163.com

李浩川，曲彥志，楊繼偉，崔麗洋，毛熙嵐，劉宗華. 基于核磁共振的玉米不同籽粒類型單粒質量和含油率分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2018，34(20)：183－188. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.20.023 http://www.tcsae.org

Li Haochuan, Qu Yanzhi, Yang Jiwei, Cui Liyang, Mao Xilan, Liu Zonghua. Analysis on single kernel weight and oil content of different grain types in maize based on NMR[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(20): 183－188. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.20.023 http://www.tcsae.org