魏磊 李曉 王學(xué)方 景炳年 陳飛 崔煒 郭唯 杜美 王偉

摘 要 目的：優(yōu)化紫蘇葉總?cè)频某曁崛」に?，并考察其?0種常見致病菌的抑菌作用。方法：以紫蘇葉總?cè)铺崛×繛轫憫?yīng)值，以料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲溫度為響應(yīng)因子，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉總?cè)频某曁崛」に?；采用微量二倍稀釋法測定紫蘇葉總?cè)茖?0種常見致病菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以考察其抑菌作用。結(jié)果：優(yōu)化的紫蘇葉總?cè)瞥曁崛」に嚍榱弦罕? ∶ 30[m（g）/V（mL）]，乙醇體積分數(shù)85%，超聲時間65 min，超聲溫度75 ℃。在此條件下的紫蘇葉總?cè)铺崛×繛?7.90 mg/g，與預(yù)測值（38.40 mg/g）的相對誤差為1.30%，實測值與預(yù)測值一致性良好。抑菌作用考察結(jié)果表明，紫蘇葉總?cè)茖?0種常見致病菌的MIC范圍為0.48～15.50 mg/mL，MBC≥0.97 mg/mL，整體抑菌作用較強，尤其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌作用最強。結(jié)論：優(yōu)化所得紫蘇葉總?cè)频某曁崛」に嚪€(wěn)定、可行；紫蘇葉總?cè)凭哂休^強的廣譜抗菌作用，且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抗菌作用相當(dāng)。

關(guān)鍵詞 紫蘇葉；總?cè)?；超聲提取工藝；響?yīng)面法；致病菌；抑菌作用；微量二倍稀釋法

中圖分類號 R284.2 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2193-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the ultrasonic extraction technology of total triterpenoids from the leaves of Perilla frutescens （TPL） and investigate its antibacterial activities against 10 kinds of common pathogens. METHODS： Using the extraction amount of triterpenoids as response value， the ultrasonic extraction technology of TPL was optimized by response surface methodology on the basis of single factor test with solid-to-liquid ratio， ethanol volume fraction， ultrasonic time and temperature as factors. The MIC and MBC of TPL on 10 kinds of common pathogens were detected by double broth dilution method， so as to investigate antibacterial activities. RESULTS： The optimal ultrasonic extraction technology of TPL included solid-to-liquid ratio of 1 ∶ 30 [m（g）/V（mL）]， ethanol volume fraction of 85 %， ultrasonic time of 65 min and ultrasonic temperature of 75 ℃. Under these conditions， the amount of triterpenoids was 37.90 mg/g， relative error of which to predicted value （38.40 mg/g） was 1.30%. Measured value agreed well with predicted value. Results of antibacterial activities study showed that MIC were in the range of 0.48-15.50 mg/mL，and MBC≥0.97 mg/mL. TPL showed significant antibacterial activities， especially to Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. CONCLUSIONS： Optimized ultrasonic extraction technology of TPL is stable and feasible. TPL extracted has strong broad-spectrum antibacterial effect and shows similar antibacterial effecton E.coli， S. anreus and P. aeruginosa.

KEYWORDS Perilla frutescens； Total triterpenoids； Ultrasonic extraction technology； Response surface methodology； Pathogens； Antibacterial activities； Double broth dilution method

紫蘇[Perilla frutescens（L.） Britt.]為唇形科一年生草本植物，藥食兩用，具有解表散寒、下氣消痰、潤肺寬腸之功效[1]，富含色素類、萜類、黃酮類、酚類等多種活性成分[2]。植物中所含三萜類化合物因具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血糖、調(diào)控免疫等多種藥理活性且毒性較低而受到廣泛關(guān)注[3-7]。紫蘇葉是紫蘇的主要藥用部位之一，而目前針對紫蘇葉總?cè)频暮?、提取工藝及藥理活性等方面的研究尚未見報道?/p>

提取是分離和純化生物活性物質(zhì)最初始且重要的一步，多種因素（如溫度、時間、料液比等）會影響提取效率和產(chǎn)量[8]，因此優(yōu)化提取工藝對實現(xiàn)最大程度地提取生物活性物質(zhì)十分重要。超聲提取技術(shù)具有提取效率高、耗能低、不破壞活性物質(zhì)等優(yōu)點[9]。響應(yīng)面法可以對多種工藝參數(shù)及其相互作用的有效性進行分析[10]，近年來在優(yōu)化黃酮類[11]、多酚類[12]等生物活性物質(zhì)的超聲提取工藝中得到廣泛應(yīng)用。鑒于此，本研究采用響應(yīng)面法對紫蘇葉總?cè)频某曁崛」に囘M行了優(yōu)化，并考察了提取所得的紫蘇葉總?cè)茖?0種常見致病菌的抑菌作用，旨在為紫蘇葉總?cè)频倪M一步研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TU-1810型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；YJ-VS-2型超凈工作臺（無錫一凈凈化設(shè)備有限公司）；SYQ-DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；wi93008型麥氏比濁儀[東西儀（北京）科技有限公司]；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海紅華儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XMTD-7000型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；ME-204型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 菌種與試劑

大腸桿菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、化膿性鏈球菌（ATCC 19615）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311）、肺炎鏈球菌（ATCC 49619）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）均購自南京便診生物科技有限公司；糞腸球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、都柏林沙門氏菌均為河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室保存的臨床分離菌種；胰蛋白胨（上海寶錄生物科技有限公司，批號：1205026）；牛肉浸膏（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，批號：000606）；瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司，批號：1108S0312）；D101大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細化工研究所，批號：20171119）；微量最低抑菌濃度（MIC）測定板（美國Corning公司，批號：07816604）；氯化鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號：20170810）；齊墩果酸標(biāo)準品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：121213，純度：≥98%）；無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純（北京化工廠），水為蒸餾水。

1.3 藥材

紫蘇葉樣品于2017年5月購于河南省鄭州市中草藥批發(fā)市場，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為唇形科植物紫蘇[Perilla frutescens（L.） Britt.]的干燥葉（或帶嫩枝）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

采用紫外分光光度法[13]。

2.1.1 線性關(guān)系考察 以甲醇為溶劑制備0.4 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準品溶液，準確吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，分別置于10 mL量瓶中，水浴揮盡溶劑后，加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫，加冰醋酸定容至10 mL，搖勻，于550 nm波長處測定吸光度。以齊墩果酸檢測質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y=28.175x-0.007 3（r=0.999 2）。結(jié)果表明，齊墩果酸質(zhì)量濃度的線性范圍為0～0.02 mg/mL。

2.1.2 方法學(xué)考察 紫蘇葉樣品干燥后粉碎，過60目篩，精密稱定1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，加入60%乙醇溶液20 mL，50 ℃下超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）提取40 min，合并濾液，濃縮并定容至10 mL量瓶中，作為供試品溶液。（1）精密度試驗：取同一齊墩果酸標(biāo)準品溶液0.10 mL，按“2.1.1”項下“置于10 mL量瓶中……搖勻”操作，于550 nm波長處連續(xù)測定6次吸光度，結(jié)果RSD為1.73%（n=6），表明儀器精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗：取上述供試品溶液7份，分別于室溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min后于550 nm波長處測定吸光度，結(jié)果RSD為0.83%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。（3）重復(fù)性試驗：取上述供試品溶液6份，分別于550 nm波長處測定吸光度，結(jié)果RSD為1.30%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。（4）加樣回收率試驗：取上述供試品溶液適量，共6份，分別加入一定量的齊墩果酸標(biāo)準品溶液，于550 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結(jié)果加樣回收率為97.67%～101.21%（RSD=1.18%，n=6）。以上方法學(xué)驗證結(jié)果顯示，本方法穩(wěn)定、可靠，可用于紫蘇葉總?cè)频暮繙y定。

2.1.3 紫蘇葉總?cè)坪康臏y定 精密稱定紫蘇葉樣品粉末1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，按一定料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，在一定溫度下超聲提取一定時間，濾過后按上述條件重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮并以一定體積分數(shù)的乙醇溶液定容至10 mL，于550 nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算總?cè)频暮?。總?cè)铺崛×?總?cè)瀑|(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/紫蘇葉樣品質(zhì)量。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?精密稱定紫蘇葉樣品粉末1.00 g，按“2.1.3”項下方法，在60%乙醇溶液、超聲時間50 min、超聲溫度50 ℃條件下，考察不同料液比[1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35， m（g）/V（mL）]對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?，結(jié)果見圖1A。結(jié)果顯示，隨料液比的增大，紫蘇葉總?cè)频奶崛×恐饾u增加，當(dāng)料液比為1 ∶ 30時，提取量不再增加，故為節(jié)省試劑選擇料液比為1 ∶ 30。

2.2.2 乙醇體積分數(shù)對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?精密稱定紫蘇葉樣品粉末1.00 g，按“2.1.3”項下方法，在料液比1 ∶ 30、超聲時間50 min、超聲溫度50 ℃條件下，考察不同乙醇體積分數(shù)（20%、40%、60%、80%、100%）對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?，結(jié)果見圖1B。結(jié)果顯示，隨乙醇體積分數(shù)的增大，紫蘇葉總?cè)频奶崛×恐饾u增加，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為80%時，提取量最高；而當(dāng)乙醇體積分數(shù)達100%時，提取量有所降低，這可能是因為紫蘇葉中三萜類化合物的極性與80%乙醇溶液最接近，故選擇乙醇體積分數(shù)為80%。

2.2.3 超聲時間對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?精密稱定紫蘇葉樣品粉末1.00 g，按“2.1.3”項下方法，在料液比1 ∶ 30、80%乙醇溶液、超聲溫度50 ℃條件下，考察不同超聲時間（20、40、60、80、100 min）對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?，結(jié)果見圖1C。結(jié)果顯示，隨超聲時間的延長，紫蘇葉總?cè)频奶崛×烤徛黾?，?dāng)超聲時間為60 min時，提取量最高；之后又逐漸降低，這可能是因為超聲時間過長會使紫蘇葉中三萜類化合物部分發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，故選擇超聲時間為60 min。

2.2.4 超聲溫度對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?精密稱定紫蘇葉樣品粉末1.00 g，按“2.1.3”項下方法，在料液比1 ∶ 30、80%乙醇溶液、超聲時間60 min條件下，考察不同超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?，結(jié)果見圖1D。結(jié)果顯示，隨超聲溫度的升高，紫蘇葉總?cè)频奶崛×烤徛仙?，?dāng)超聲溫度為70 ℃時，提取量最高；之后又逐漸降低，這可能是因為超聲溫度過高會影響紫蘇葉中三萜類化合物的穩(wěn)定性，故選擇超聲溫度為70 ℃。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉總?cè)频某曁崛」に?/p>

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與分析 在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計，以A（料液比）、B（乙醇體積分數(shù)）、C（超聲時間）、D（超聲溫度）這4個因素為響應(yīng)因子，以紫蘇葉總?cè)铺崛×繛轫憫?yīng)值，采用4因素3水平共29組試驗對提取工藝進行優(yōu)化[14]。因素與水平見表1，試驗方案與結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得紫蘇葉總?cè)铺崛×浚╕）對A、B、C、D的數(shù)學(xué)回歸模型為：Y=37.504 0+1.675 0A+1.366 7B+0.031 666 7C+1.643 3D+1.275 0AB+1.425 0BC+0.965 0BD-5.451 2A2-5.166 2B2-0.853 67C2-1.468 7D2[決定系數(shù)（R2）=0.953 6，調(diào)整決定系統(tǒng)（Radj2）=0.927 8，預(yù)測決定系統(tǒng)（PredR2）=0.868 6]。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3（表中，*表示P<0.05，**表示P<0.01）。

由表3可知，本試驗所建模型的P<0.000 1，表明該模型具有顯著性；同時，模型失擬項的P=0.548 4>0.05，不具有顯著性，說明模型與實際情況吻合較好，試驗誤差較小。方差分析結(jié)果得出，R2和Radj2分別為0.953 6和0.927 8，說明該模型擬合度良好；Pred R2為0.868 6，說明該模型預(yù)測性能良好。

方差分析結(jié)果表明，模型中A、B、D、A2、B2、D2對響應(yīng)值影響有顯著性差異，即各因素對提取量影響大小順序為A>D>B>C。AB、BC交互作用顯著，說明不同提取條件與紫蘇葉總?cè)铺崛×坎⒎呛唵蔚木€性關(guān)系。

2.3.2 各因素交互作用分析 響應(yīng)面等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。從響應(yīng)面等高線圖的分布規(guī)律和間隔距離可以看出因素間交互作用的強弱和因素對響應(yīng)值的影響程度[15]。為確定A（料液比）、B（乙醇體積分數(shù)）、C（超聲時間）、D（超聲溫度）兩兩交互作用對紫蘇葉總?cè)铺崛×康挠绊?，采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面和等高線圖，詳見圖2。由圖2可知，因素A與B的等高線呈橢圓形，提示二者交互作用最為顯著；因素B與C的交互作用次之；因素B與D的等高線近似圓形，提示二者交互作用不顯著。

2.3.3 最優(yōu)提取工藝的確定及驗證試驗 采用Design-Expert 8.0.6軟件對所建模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得到紫蘇葉總?cè)频淖顑?yōu)提取工藝條件為：料液比1 ∶ 30.9，乙醇體積分數(shù)84.8%，超聲時間64.4 min，超聲溫度76.4 ℃。為適合實際操作，調(diào)整后的最優(yōu)提取工藝條件為：料液比1 ∶ 30，乙醇體積分數(shù)85%，超聲時間65 min，超聲溫度75 ℃。在此條件下進行驗證試驗，平行操作5次，得紫蘇葉總?cè)频钠骄崛×繛?7.90 mg/g，達到預(yù)測提取量（38.40 mg/g）的98.70%，相對誤差為1.30%。提示采用響應(yīng)面法優(yōu)化所得的紫蘇葉總?cè)频某曁崛」に嚪€(wěn)定、可行。

2.4 抑菌作用研究

2.4.1 紫蘇葉總?cè)频闹苽?D101大孔吸附樹脂經(jīng)乙醇和蒸餾水預(yù)處理后，濕法裝柱，平衡后上樣（紫蘇葉醇提物），分別用蒸餾水和30%、50%、85%乙醇溶液依次洗脫，收集85%乙醇溶液洗脫液，濃縮，凍干，制備紫蘇葉總?cè)?，稱定質(zhì)量，加入乙醇-水（1 ∶ 1，V/V）定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為31 mg/mL的紫蘇葉總?cè)颇敢骸?/p>

2.4.2 菌懸液的制備 10種致病菌樣本復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L）上，27 ℃培養(yǎng)12～24 h。從平板上選取已純化的單個菌落，分別混懸于制備好的液體培養(yǎng)基中，制成10種濃度均為1×106～1×108 CFU/mL的菌懸液，備用。

2.4.3 MIC和最低殺菌濃度（MBC）的測定 采用微量二倍稀釋法[16]測定紫蘇葉總?cè)频腗IC和MBC。取“2.4.1”項下的紫蘇葉總?cè)颇敢?，?jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，用制備好的液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、氯化鈉10 g/L）倍比稀釋9個梯度濃度后，依次加入微量MIC測定板中，每孔0.1 mL，再分別加入“2.4.2”項下的10種菌懸液，每孔0.1 mL。每個菌種分別設(shè)置陽性對照（孔中只加入菌懸液0.1 mL和液體培養(yǎng)基0.1 mL）和陰性對照（孔中只加入液體培養(yǎng)基0.2 mL）。將微量MIC測定板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，完全沒有細菌生長時的最低藥物濃度即為MIC。從無細菌生長的各孔取樣，分別涂布于無菌瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，以平板培養(yǎng)基上無細菌生長的最低藥物濃度為MBC。抑菌試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，紫蘇葉總?cè)茖?0種常見致病菌的MIC范圍為0.48～15.50 mg/mL，MBC≥0.97 mg/mL，整體抑菌作用較強，且抗菌譜廣；尤其是對大腸桿菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）的抑菌作用最強。

3 討論

本研究采用響應(yīng)面法分析得到紫蘇葉總?cè)频淖顑?yōu)提取工藝為：料液比1 ∶ 30，乙醇體積分數(shù)85%，超聲時間65 min，超聲溫度75 ℃。此條件下得到的紫蘇葉總?cè)铺崛×繛?7.90 mg/g，驗證試驗結(jié)果顯示以上值與理論預(yù)測值（38.40 mg/g）的一致性良好，提示該方法優(yōu)化所得的紫蘇葉總?cè)频奶崛」じ曳€(wěn)定、可行，可為紫蘇葉總?cè)频墓I(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

本研究還考察了紫蘇葉總?cè)茖?0種常見致病菌的抑菌作用。有研究認為，植物單體化合物或粗提物MIC分別低于1、8 mg/mL時，可認為其有潛在的治療價值[16]。本研究結(jié)果顯示，紫蘇葉總?cè)茖ζ渲?種致病菌的MIC為0.48～7.75 mg/mL，提示其可作為潛在的天然廣譜抗菌藥物加以開發(fā)。此外，革蘭氏陰性菌與陽性菌形態(tài)不同，現(xiàn)有的抗陽性菌植物藥種類較多，而抗陰性菌植物藥種類較少[17-18]。紫蘇葉總?cè)茖Ω锾m氏陰性菌和陽性菌表現(xiàn)出的抗菌作用相當(dāng)，有助于豐富抗陰性菌植物藥種類。但本研究仍存在一定的局限性，如未確定三萜類化合物的具體種類和成分，且未對其體內(nèi)抗菌作用進行評價，故后續(xù)研究將持續(xù)進行。

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（收稿日期：2018-02-09 修回日期：2018-05-21）

（編輯：陳 宏）