羅 晶 丁 麗 肖玉紅

（中國人民解放軍第二○二醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 132011）

糖尿病（diabetes mellitus）目前已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅國民健康的最重要的內(nèi)分泌疾病之一[1]。研究表明其發(fā)病具有遺傳易感性，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。妊娠期糖尿病（GDM）與糖尿病發(fā)病機(jī)制相似[2]，其主要是指妊娠后首次出現(xiàn)的不同程度糖耐量減低的疾病[3]。近年來GDM的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。它不但影響胎兒的宮內(nèi)發(fā)育，而且還會對胎兒出生后的健康產(chǎn)生不利影響。通過線粒體基因突變的檢測，對GDM的發(fā)病進(jìn)行預(yù)測，并給予干預(yù)，將對GDM的防治有重要意義。本研究通過對GDM患者進(jìn)行線粒體基因突變類型的篩查，并與健康對照組進(jìn)行比較，分析線粒體基因突變是否參與GDM的發(fā)病過程。

1 材料與方法

1.1 臨床資料：選取2012年7月至2013年6月因停經(jīng)就診于沈陽軍區(qū)202醫(yī)院婦科門診確診妊娠者296例，并簽署知情同意書。排除糖尿病合并妊娠（第1次孕檢FPG≥7.0 mmol/L），患有心肝腎和其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病等可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果者。妊娠糖尿病的診斷參考2010年國際妊娠期糖尿病專家組制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]：妊娠24～28周時(shí)，OGTT 0 h≥5.1 mmol/L或1 h≥10.0 mmol/L或2 h≥8.5 mmol/L，任意一點(diǎn)血糖達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)可診斷。同時(shí)在妊娠24～28周收集妊娠者的外周靜脈血樣本。其中妊娠糖尿病組有146例，年齡（27.5±3.9）歲；正常對照組有150例，年齡（29.5±4.8）歲。根據(jù)知情同意原則，常規(guī)抽取外周靜脈血，用以進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.2 基因組DNA提取：取外周靜脈血2 mL，加0.2 mLEDTA抗凝劑，充分混勻。采用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA，并進(jìn)行DNA濃度及純度的測定。

1.3 PCR擴(kuò)增：采用英國Pregene公司PCR擴(kuò)增儀。3394引物：上游為5'-TACTYCACAAAGCGCCTYCC-3'，下游為5'-ATGAAGAATAGGGC GAAGGG-3'。3316引物：上游為5'-CACCCAAGAACAGGG1TITI1GT-3'，下游為5'-CGTCAGCGAAGGGTFGTAGT-3'。3243引物：上游引物為5'-AGCGCCTTCCCCCGTAAATGA-3'，下游引物為5'-AGAATGA TGGCTAGGGTGACTTC-3'。

1.4 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系25 μL，含50 ng DNA，70 pmol/L引物，200 μmol/LdNTPs，50 mmol/LTris-HCl（pH8.8），1.5 mmol/LMgC12，0.15%Triton-100，1.5 U TaqDNA聚合酶。

1.5 PCR條件：PCR熱循環(huán)在icyclerTMThermalrealcycler（Bio-Rad）上進(jìn)行。95 ℃預(yù)變性5 min，然后按95 ℃ 30 s 、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)30次，72 ℃延長5 min，4 ℃保存。

1.6 點(diǎn)突變檢測：點(diǎn)突變檢測采用瓊脂糖凝膠電泳，直接測序法（Sanger法）測序，測序工作在測序生物公司完成，序列比對采用Seqman和Chromas軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件分析?；蛲蛔兾稽c(diǎn)在健康對照組和妊娠期糖尿病組中的頻率分布的差異用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

線粒體G3316A基因突變：妊娠期糖尿病組中檢出G3316A突變7例（4.79%），健康對照組檢出1例（0.67%），G3316A突變在妊娠期糖尿病組發(fā)生率顯著高于對照組（P＜0.05）。線粒體A3243G基因突變：妊娠期糖尿病組中檢出A3243G突變5例（3.42%），健康對照組檢出0例，A3243G突變在妊娠期糖尿病組發(fā)生率顯著高于對照組（P＜0.05）。在妊娠期糖尿病與正常對照組中均未發(fā)現(xiàn)T3394C位點(diǎn)的突變。見表1。

表1 妊娠糖尿病組與正常對照組G3316A、A3243G、T3394C基因突變位點(diǎn)比較

3 討 論

線粒體DNA與核DNA比較更容易受到損傷，因此突變率要高10～20倍。線粒體基因突變引起的線粒體功能障礙可引起線粒體疾病，與腫瘤、糖尿病等密切相關(guān)[5-8]。最常見的引起2型糖尿病的線粒體基因突變是tRNALeu（UUR）基因A3243G，其次是ND1基因G3316A、T3394C、A3426G和ND4基因A12026G，以及D環(huán)區(qū)的T16189C。閾值效應(yīng)是mtDNA突變基因的表型表達(dá)的特征之一，臨床表型的變化是否出現(xiàn)取決于突變的mtDNA數(shù)量是否超過一定的閥值[9]。mtDNA基因突變造成線粒體功能障礙，能量供應(yīng)不足引起β細(xì)胞功能低下[10]。線粒體功能障礙還會影響細(xì)胞對葡萄糖的有氧代謝能力，從而產(chǎn)生胰島素抵抗的現(xiàn)象[11]。GDM有母系遺傳的傾向，所以線粒體基因突變很可能在妊娠糖尿病的發(fā)病過程中發(fā)揮更加重要的作用。本研究共包括妊娠期糖尿病組149例，對照組150例，研究結(jié)果表明線粒體基因A3243G、G3316A突變與妊娠期糖尿病發(fā)病有關(guān)。線粒體基因T3394C突變并未在本研究的妊娠期糖尿病患者和健康對照組中，可能與樣品量有限和地區(qū)差異有關(guān)。總之，本研究結(jié)果表明，在遼寧地區(qū)人群中，妊娠期糖尿病與mtDNA3243、3316位點(diǎn)的突變具有相關(guān)性。對于線粒體DNA突變?nèi)绾卧谌焉锲谔悄虿“l(fā)病過程中起作用，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更加深入的研究。